山桐子油對力竭運動大鼠心肌線粒體的保護作用

潘文文，吳立明，崔 潔

(1.齊齊哈爾大學體育學院,黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2.河北對外經貿職業學院 體育部， 河北 秦皇島 066311； 3.哈爾濱工業大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150086)

山桐子，別名水冬瓜、水東桐、椅桐等，屬落葉喬木。山桐子主要分布在中國、日本、朝鮮等東亞國家，在我國主要分布在四川、陜西、云南、貴州等省份[1]。山桐子對于環境的適應性很強，具有耐寒、耐旱、耐高低溫等特點[2]。山桐子的果肉占果實總質量的62.3%，種子占37.6%，山桐子的果實、種子、果肉都可以用作油料，但是其不同部位的含油率差距較大，果肉含油率為43.6%，種子含油率為22.4%～25.9%[3-4]。山桐子油的脂肪酸組成很豐富，不飽和脂肪酸含量達到82%以上，其中包括亞油酸66%以上、油酸6.6%以上，果肉油還含棕櫚酸5.12%，具有很高的食用價值[5]。山桐子油還含有一些甾醇類物質β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，其中β-谷甾醇相對含量較高，山桐子油維生素E含量高達111.75 mg/g[6-7]。生育酚是一種重要的生物抗氧化劑和自由基清除劑，可以增強機體的抗氧化能力和免疫能力[8]。當前對于山桐子油的研究主要集中在栽培、繁育等方面，對于食用價值以及營養保健方面研究甚少。

目前，大強度體育訓練導致運動員猝死的事件頻頻發生。研究表明，力竭運動可以造成心肌組織功能損傷形成氧化應激，導致細胞凋亡、Ca2+超載以及能量代謝障礙等[9]。線粒體是能量產生的主要場所，其主要作用是改變心肌能量代謝障礙，機體在力竭運動時會產生較多的自由基，自由基增多產生細胞毒性，導致心肌損傷[10]。本文通過建立力竭大鼠模型，研究山桐子油對力竭大鼠心肌線粒體的影響，以期為山桐子油的應用開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

山桐子，采自福建省華安地區；正己烷，天津科密歐試劑有限公司；活性白土(食品級)，濟南奧凱化工有限公司；氫氧化鉀，天津科密歐試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司；ATP試劑盒、Ca2+試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司。

50只健康SD雄性大鼠，平均體重(180±5)g，北京科宇動物養殖中心(SYXK(京)2012-0004)。

TGL-16M型高速離心機，常州市金壇高科儀器廠；XB120A-SCS型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；SA101型動物實驗跑臺，江蘇賽昂斯生物科技有限公司；QM-SXT-2型索氏提取器，琪摩(上海)電子科技有限公司；RE-501L型旋轉蒸發儀，上海科升儀器有限公司；安捷倫6890N+5973氣相色譜質譜聯用儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山桐子油的制備

將山桐子洗凈并晾干，稱取適量，粉碎過40目篩，放入索氏提取器中，加入正己烷，加熱回流2.5 h，減壓蒸餾并回收溶劑，得到山桐子毛油。山桐子毛油經堿煉脫酸、白土脫色后得到山桐子油[11-12]。

1.2.2 山桐子油理化指標測定

酸價測定，參照GB/T 5510—2011；碘值測定，參照GB/T 5532—2008；皂化值測定，參照GB/T 5534—2008；甾醇、維生素E含量測定，參照文獻[13] 。

1.2.3 山桐子油主要脂肪酸組成分析

山桐子油經甲酯化后進行氣相色譜-質譜分析。

氣相色譜條件：安捷倫DB-624毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)；升溫程序為155℃保持5 min，5℃/min升至240℃，保持20 min；載氣為高純度氮氣，流量為1.0 mL/min；柱前壓90.6 kPa；進樣量1 μL；分流比20∶1。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度200℃；電子能量70 eV；接口溫度240℃；溶劑延時4 min；倍增器電壓1.5 kV；掃描范圍 40～500 u。

1.2.4 實驗動物分組以及測試

將大鼠隨機分成5組，分別為對照組，力竭運動組，低、中、高劑量山桐子油組，其中對照組不進行任何運動，力竭運動組進行跑步運動訓練，低、中、高劑量山桐子油組進行跑步運動訓練的同時，運動后2 h分別灌胃山桐子油50、100、150 mg/kg。實驗持續6周，每周6 d，周日休息。

跑步運動訓練方法：將除了對照組之外的其余4組SD大鼠放置在運動跑臺上進行訓練，第一周先進行適應性訓練，每組大鼠進行0°、10 m/min、30 min的運動，第二周開始每組大鼠進行5°、20 m/min的運動，直至力竭，記錄大鼠運動的力竭時間。判斷力竭的標準為：使用毛刷刺激大鼠尾部，如果大鼠跟不上預設速度，臀部壓在跑臺上，大鼠的后肢跟隨轉動跑臺的皮帶后拖達到30 s[14]。

在訓練周的最后一日，待力竭運動組，低、中、高劑量山桐子油組進行完力竭運動后，將以上4組和對照組的大鼠立即斷頭處死，取出心臟，并用生理鹽水沖凈，取心肌組織30 mg，在冰浴中將心肌組織剪成碎片，加生理鹽水制備10%的勻漿，過濾并棄濾渣，濾液在3 300 r/min下離心10 min，棄上清液，沉淀即為心肌線粒體，用生理鹽水制成線粒體混懸液，于4℃留存備用。

1.2.5 SOD、GSH-Px、CAT、MDA、ATP、Ca2+含量測定

根據相應試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，數據均用“均值±標準差”表示，采取組間對比，P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 山桐子油理化指標及主要脂肪酸組成

經測定，山桐子油酸價(KOH)為 0.864 mg/g，皂化值(KOH)為207.996 mg/g，碘值(I)為124 g/100 g ，不皂化物中甾醇相對含量為25.14%，維生素E的相對含量為18.34%。

從山桐子油中檢測出5種主要脂肪酸(見表1)，分別為亞油酸、棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸和硬脂酸，其中亞油酸含量最高。

表1 山桐子油中主要脂肪酸組成

2.2 山桐子油對力竭運動大鼠心肌線粒體ATP合成能力以及Ca2+含量的影響(見表2)

由表2可見，力竭運動組與對照組相比，ATP合成能力明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組ATP合成能力呈上升趨勢，高劑量組的ATP合成能力與力竭運動組相比明顯增加(P<0.05)。ATP作為直接供給心肌能量的重要高能磷酸化合物，主要在線粒體中合成，力竭運動后ATP含量明顯降低，導致了一系列代謝的異常和紊亂。山桐子油可以提高心肌線粒體內ATP的合成能力，改善大鼠力竭運動之后引起的ATP含量降低。力竭運動組與對照組相比Ca2+含量極顯著增加(P<0.01)，低、中、高劑量山桐子油組Ca2+含量呈下降趨勢，其中高劑量山桐子油組的Ca2+含量與對照組相比不具有顯著性差異(P>0.05)，低、中劑量山桐子油組的Ca2+含量與力竭運動組相比明顯降低(P<0.05)，高劑量山桐子油組的Ca2+含量與力竭運動組相比極顯著降低(P<0.01)。鈣是心肌細胞中維持正常生理功能的重要指標，細胞鈣代謝異常會引起機體各種功能障礙，Ca2+轉運主要依靠線粒體進行，力竭運動后，大量自由基生成，導致滲透性轉運通道打開，使Ca2+大量釋放，使細胞漿中Ca2+含量升高，導致鈣超載，山桐子油中含有生育酚類物質，是一種重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可在機體內起穩態調節的作用[8]，同時當Ca2+內流超過正常時，生育酚類物質可以起到Ca2+拮抗劑的作用，表明機體在長時間的力竭運動中，Ca2+轉運是運動性疲勞更為敏感的指標，山桐子油對細胞內的Ca2+起到穩態調節的作用。

表2 山桐子油對力竭運動大鼠心肌ATP合成能力 以及Ca2+含量的影響

注：各組與對照組相比，#表示有顯著差異(P<0.05)，##表示有極顯著差異(P<0.01)；與力竭運動組相比較，*表示有顯著差異(P<0.05)，* *表示有極顯著差異(P<0.01)。下同。

2.3 山桐子油對力竭運動大鼠心肌線粒體SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影響(見表3)

表3 山桐子油對力竭運動大鼠心肌線粒體SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影響 U/mg

由表3可見：力竭運動組與對照組相比SOD活性明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組SOD活性呈上升趨勢，高劑量山桐子油組的SOD活性與力竭運動組相比明顯增加(P<0.05)；力竭運動組與對照組相比GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，低、中、高劑量山桐子油組GSH-Px活性呈上升趨勢，低、中劑量山桐子油組的GSH-Px活性與力竭運動組相比明顯提高(P<0.05)，高劑量山桐子油組的GSH-Px活性與力竭運動組相比極顯著提高(P<0.01)；力竭運動組與對照組相比CAT活性明顯降低(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組CAT活性呈上升趨勢，高劑量山桐子油組的CAT活性與力竭運動組相比明顯增加(P<0.05)。機體通過長時間的力竭運動之后可以導致心肌線粒體內抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性明顯下降，心肌線粒體內自由基增多，特別是過氧化物大量堆積，抗氧化酶被大量催化歧化反應而消耗，從而抑制SOD、GSH-Px、CAT的活性。SOD、GSH-Px、CAT具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質[15]。山桐子油具有較強的抗氧化能力，可以清除由力竭運動產生的大量自由基，進而提高SOD、GSH-Px、CAT的活性。

由表3還可以看出，力竭運動組與對照組相比MDA含量明顯提高(P<0.05)，低、中、高劑量山桐子油組MDA含量呈下降趨勢，高劑量山桐子油組與力竭運動組相比明顯降低(P<0.05)。長時間力竭運動后MDA含量增加，MDA作為自由基與不飽和脂肪酸反應生成的代謝產物，可以反映機體的自由基代謝變化，作為機體內脂質過氧化反應的代謝產物，對細胞具有嚴重的損傷作用，心肌損傷導致ATP合成能力不足，無氧酵解增加，乳酸堆積，pH下降，細胞內酸中毒，致使線粒體腫脹[14]。山桐子油可以刺激抗氧化酶的活性，清除自由基，提高ATP合成能力，減少乳酸堆積，阻止pH降低，提高心肌收縮能力，從而降低MDA的含量，減少對細胞的損傷。

3 結 論

大鼠在經過力竭實驗后，不同劑量的山桐子油對大鼠的心機線粒體影響不同，但均會增加ATP合成能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低Ca2+含量、MDA含量，并且以上指標呈量效關系。因此，山桐子油對力竭運動大鼠心肌線粒體的保護有很好的干預作用。