超高壓和加熱處理對菜籽蛋白功能性質和結構的影響研究

戴彩霞，何 榮

(南京財經大學 食品科學與工程學院，南京 210023)

油菜是我國主要的油料作物之一，每年榨油產生的副產物菜籽粕約600萬t，菜籽粕中蛋白質含量達35%～40%[1]，極具開發價值。菜籽蛋白具有很高的營養價值，沒有限制性氨基酸，氨基酸的組成也非常合理，尤其是含有足夠的堿性氨基酸(賴氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸、半胱氨酸)[2]，基本符合FAO與WHO的推薦模式。由于菜籽蛋白極好的氨基酸平衡組成和高生物利用度，菜籽蛋白被認為是飲食蛋白質的合適來源[3]。

和很多植物蛋白一樣，菜籽蛋白的溶解性較差[4]，在很大程度上限制了其應用?，F代技術采用多種方法可以提高蛋白質的利用率。通過化學改性[5]制備水凝膠，提高蛋白質的溶解性和組織親和性，可以應用于藥物傳遞和組織修復工程。Zhang等[6]采用酶解的方法，改善了菜籽蛋白的溶解性，制備了機械性能良好的可食性菜籽蛋白水解物復合膜，可用作食品包裝材料。Ji等[7]研究發現，與水浴加熱相比，微波處理的魚糜蛋白質-多糖凝膠的結構更加緊密穩定，持水性更好，對于魚產品加工具有指導意義。因此，可以采用化學、物理或酶處理的方式來改善蛋白質的性質，以期達到動植物蛋白的多元化應用。

本實驗的目的是研究超高壓處理和加熱處理對菜籽蛋白功能性質及結構變化的影響，從而為菜籽蛋白的合理加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

菜籽粕，中糧東海油脂工業有限公司；菜籽油，市售；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)等，分析純，Fisher公司。

1.1.2 儀器與設備

4-1 HP高壓反應系統，包頭科發高壓科技有限責任公司；J-26 XP高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司；IKA磁力攪拌器，德國IKA儀器設備有限公司；HH-2數顯水浴鍋，常州國華電器有限公司；FE 20K pH計，瑞士METTLER TOLEDO公司；ZS-90納米激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；JASCOJ-815型分光偏振計，日本JASCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽分離蛋白的制備

根據Wang等[8]的方法從菜籽粕中提取菜籽分離蛋白(RPI)。將菜籽粕溶于蒸餾水(質量體積比1∶10)中，用1 mol/L NaOH調節pH至11.0，室溫攪拌2 h，然后在4℃、10 000 r/min下離心20 min。 收集上清液，用1 mol/L HCl調節至pH 4.5，靜置，離心(10 000 r/min，30 min)。用乙醇(除去多酚組分)洗滌沉淀兩次，然后在蒸餾水中透析沉淀，在4℃下每2 h更換蒸餾水，24 h后取出沉淀并冷凍干燥以獲得RPI。

1.2.2 菜籽蛋白的超高壓處理和加熱處理

用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)制備1%的菜籽分離蛋白懸濁液，置于4℃條件下攪拌12 h。將懸濁液密封在聚乙烯袋中，然后放入可以調節溫度與壓力的高壓裝置中。在保持25℃條件下，調節壓力為200、400、600 MPa，分別處理15 min。同樣地，將懸濁液分別在60、80、100℃條件下水浴加熱15 min。然后取出，冰水冷卻后冷凍干燥，-20℃儲藏備用。

1.2.3 溶解性的測定

將不同加熱處理與超高壓處理的菜籽分離蛋白制備成溶液，用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH調節pH分別為3、4、5、6、7、8和9，攪拌30 min使樣品混勻，靜置2 min后，將上層液倒入離心管中離心(5 000 r/min, 20 min)。取上清液，采用考馬斯亮藍法[9]測定蛋白質含量。同時以不作處理的菜籽分離蛋白作為對照組進行處理，下文同理。溶解度按照公式(1)進行計算。

(1)

1.2.4 乳化穩定性的測定

參考Malomo等[10]的方法制備乳液。在pH 3、5、7、9的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中分別制備10、25、50 mg/mL的菜籽蛋白溶液，然后加入25%的菜籽油，將混合液以12 000 r/min高速剪切2 min，立即測定乳液油滴粒徑。靜置30 min后，測油滴粒徑。乳化穩定性按照公式(2)計算。

(2)

1.2.5 起泡性和泡沫穩定性的測定

配制pH分別為3、5、7和9，濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并用這些緩沖液分別制備質量濃度為5、12.5、25 mg/mL的菜籽蛋白懸液，以10 000 r/min均質2 min，將均質后的樣品迅速轉移到一個刻度量筒中，讀取泡沫體積和蛋白溶液總體積，靜置30 min后讀取泡沫體積，并按照下式計算起泡性和泡沫穩定性。

(3)

(4)

1.2.6 持水性的測定

準確稱取0.5 g蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，以300 r/min攪拌1 h后，以4 000 r/min離心20 min，去掉上清液，稱重，并按照公式(5)計算持水力。

(5)

1.2.7 持油性的測定

準確稱取0.5 g蛋白樣品于10 mL菜籽油中并旋渦振蕩混合均勻，以300 r/min攪拌1 h后，以4 000 r/min離心20 min，去掉油層，稱重，并按照公式(6)計算持油力。

(6)

1.2.8 圓二色譜的測定

配制pH分別為3、5和9，濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并用這些緩沖液配制質量濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液。使用JASCOJ-815型分光偏振計測定圓二色譜。測定條件：掃描范圍180～240 nm，光程0.1 cm，以100 nm/min速率計算橢圓率，分辨率0.2 nm，記錄的光譜各自是減去緩沖光譜后的3次掃描的平均值。圓二色譜用平均橢圓率表示，單位為deg·cm2/dmol。

1.2.9 統計分析

采用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析Duncan多重比較，以P<0.05為有顯著差異。每組實驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與討論

2.1 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性

溶解性是蛋白質最重要和最基本的性質，因為其影響著蛋白質的乳化性、起泡性、持水性和持油性等性質。圖1是不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性。

圖1 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性曲線

由圖1可知，在pH大于4時，各條件下(除100℃加熱處理和對照組外)的菜籽蛋白的溶解性均隨pH的升高而迅速上升，100℃加熱處理的菜籽蛋白的溶解性隨pH的升高先降低，pH大于7時又緩緩升高。這是由于pH 4接近蛋白質的等電點，蛋白質溶解性降低[11]，同時過高的溫度使蛋白質嚴重變性，改變蛋白質分子之間相互作用，導致蛋白質聚集，溶解性降低。菜籽蛋白在堿性條件下具有較高的溶解性，故溶解性隨pH的增加而略有升高。超高壓處理條件下，600 MPa處理的菜籽蛋白的溶解性最好，當pH為9時溶解度達到71.23%；加熱處理條件下，80℃加熱處理的菜籽蛋白溶解性最好。

2.2 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑和乳化穩定性

聚集和絮凝等變化對粒徑影響較大[12]。圖2為不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑。

注：1.對照組； 2.200 MPa； 3.400 MPa； 4.600 MPa； 5.60℃； 6.80℃； 7.100℃。下同。圖2 不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑

由圖2可知，pH 3時，相比對照組，超高壓處理使乳液粒徑增大，加熱處理則在80℃、質量濃度為10 mg/mL時乳液粒徑最小，為0.23 μm。pH 5時，接近蛋白質的等電點，蛋白質溶解性差，只在質量濃度10 mg/mL時，相比對照組，各實驗組乳液粒徑減小顯著(P<0.05)。pH為7和9時，超高壓和加熱處理對乳液粒徑的增大有一定的促進作用。總體趨勢是蛋白質量濃度越大，乳液粒徑(除pH 3時80℃和100℃加熱處理的蛋白樣品、pH 5和pH 7時100℃加熱處理的蛋白樣品)越小，酸性條件對乳液粒徑影響較大，堿性條件影響較小。

不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳化穩定性如圖3所示。

圖3 不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳化穩定性

由圖3可知：pH 3～9條件下，超高壓處理的菜籽蛋白乳化穩定性隨蛋白質量濃度的升高而增大，加熱處理的蛋白樣品乳化穩定性在pH 3和pH 5時，都是質量濃度25 mg/mL的較差，在pH 7和pH 9時，乳化穩定性均隨著蛋白質量濃度的增大而增大，且均高于同等條件下的(100℃加熱處理組除外)對照組。在酸性條件下，加熱處理的菜籽蛋白乳化穩定性整體優于超高壓處理的，在堿性條件下則相反。乳化性和乳化穩定性與蛋白的親水、親油基團的表面分布以及分子的柔順性有關。超高壓、加熱處理以及乳液的pH都會影響菜籽蛋白疏水基團、親水基團和表面電荷分布的變化[13]，因此根據不同的要求適當調整處理條件才能提高乳化穩定性。

2.3 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性和泡沫穩定性

蛋白質的起泡性和泡沫穩定性在焙烤和釀酒行業中有著重要的實際應用。圖4為不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性。

由圖4可知，pH 7和pH 9的蛋白起泡性整體優于pH 3和pH 5的，超高壓處理的蛋白起泡性整體高于加熱處理的。對于超高壓處理，壓力從200 MPa升到400 MPa，起泡性增強；繼續升至600 MPa時，起泡性減弱，但整體均優于同等條件下的對照組。對于加熱處理，在pH 3和pH 5時，起泡性隨溫度升高先升高后降低，在pH 7和pH 9時，隨溫度升高起泡性降低(蛋白質量濃度5 mg/mL除外)，但與對照組相比，加熱處理對起泡性的改善作用不大。整體而言，當蛋白質量濃度升高時，起泡性呈增強趨勢，在pH 7.0、400 MPa加壓處理、質量濃度為25 mg/mL 的蛋白起泡性最好。適當的高壓和加熱處理導致蛋白質分子解聚，疏水性增強，分子柔性增大，有利于起泡性提高，但隨溫度和壓力的升高，蛋白質過度變性，蛋白質聚集沉淀，起泡性減弱。

圖5為不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的泡沫穩定性。由圖5可知，在pH 3～7的范圍內，蛋白質量濃度為5 mg/mL時，加熱處理樣品的泡沫穩定性整體優于超高壓處理樣品的。在pH為5和7時，加熱處理的質量濃度為12.5、25 mg/mL的菜籽蛋白泡沫穩定性與對照組和超高壓處理組差異不顯著(P> 0.05)。600 MPa處理的5 mg/mL蛋白樣品，在4種pH條件下均表現出最差的泡沫穩定性。但整體來說，超高壓和加熱處理組泡沫穩定性在一定程度上優于對照組。分析認為，經超高壓和加熱處理的樣品，蛋白質分子鏈充分延展，使疏水基團充分暴露以及鏈段柔性增加，在空氣-水界面展開形成網絡結構，提高蛋白質和空氣結合的能力[14-15]，從而提高其泡沫穩定性。

圖4 不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性

圖5 不同質量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的泡沫穩定性

2.4 超高壓和加熱處理對蛋白樣品持水性和持油性的影響

超高壓和加熱處理對菜籽蛋白持水性和持油性的影響分別如圖6、圖7所示。

持水性是指蛋白質吸收和保持水分的能力，對蛋白質在食品工業中應用具有重要的意義。

圖6 不同處理菜籽蛋白的持水性

圖7 不同處理菜籽蛋白的持油性

由圖6可知，與對照組相比，200～400 MPa的超高壓處理對菜籽蛋白的持水性并無顯著性影響(P>0.05)，600 MPa的超高壓處理使菜籽蛋白持水性增加。而加熱處理對其持水性影響顯著，60、80、100℃處理的菜籽蛋白的持水力由對照組的1.50 g/g，分別升高到2.01、3.22、3.67 g/g。有研究發現超高壓處理可以提高蛋白質的持水率，并隨著壓力的增加而增大[16]，本研究中超高壓處理對持水性影響不大，這可能與蛋白質種類有關，而熱處理改變了蛋白質表面的帶電基團和極性基團，從而提高了對水的結合程度，使其持水性增強。

蛋白質的持油性對于蛋白質在保留風味物質和與油脂物質結合過程中具有重要實際應用。由圖7可知，超高壓和加熱處理都能顯著提高蛋白質的持油性。對照組菜籽蛋白的持油力為2.21 g/g，經過600 MPa超高壓處理和100℃加熱處理后可分別達到6.67、4.53 g/g，持油力分別提高了201.81%和104.98%。結合持水性來看，超高壓和加熱處理都會導致蛋白質極性基團、疏水基團暴露以及表面電荷重排，但超高壓促使更多疏水基團暴露從而結合更多的油脂，而加熱使得極性基團暴露，增加其親水性。

2.5 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的圓二色譜分析

超高壓和加熱處理對菜籽蛋白二級結構的影響可以通過圓二色譜進行分析。圖8為不同處理菜籽蛋白在pH 3、5、9下的圓二色譜圖(pH 7條件下的已經發表，具體見文獻[2]，在此不再分析)。

圖8 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的圓二色譜圖

由圖8可知，不同pH的緩沖液對超高壓和加熱處理的蛋白樣品的二級結構影響不同。對照組在不同pH的緩沖液中較為穩定，顯示在190 nm附近的正帶，在200 nm過零點，在208 nm附近有負帶。100℃處理的樣品在3種pH緩沖液中結構變化都非常劇烈，橢圓率更趨近于0，說明二級結構逐漸被破壞。80、60℃處理的蛋白樣品在pH 3和pH 5的緩沖液中變化趨勢相似，在202、222 nm處的橢圓率高于對照組，表明α-螺旋減少和β-折疊增加；pH 9時，樣品結構變化較大，60℃處理組的α-螺旋含量比80℃處理組下降明顯。超高壓處理之后，在pH 3的緩沖液中，400、600 MPa處理組促使β-折疊增加，而200 MPa促使α-螺旋減少；在pH 5的緩沖液中，超高壓對二級結構的影響較小，這與超高壓處理的β-乳球蛋白在pH 5的緩沖液中二級結構變化劇烈正好相反[17]；在pH 9的緩沖液中，超高壓導致208 nm處的橢圓率減小，這說明α-螺旋增加，并且在400 MPa處理下具有最大值，與之前報道的300 MPa處理的大豆蛋白結果類似[18]。

3 結 論

研究了超高壓和加熱處理對菜籽蛋白溶解性、乳化性、起泡性、持水性、持油性以及結構的影響。在pH大于7的條件下，與對照組相比，加熱處理使菜籽蛋白的溶解性下降，超高壓處理提高菜籽蛋白的溶解性。樣品蛋白質量濃度越大，乳液粒徑整體越小，酸性條件比堿性條件對乳液粒徑影響大，超高壓和加熱處理可在一定程度上提高乳化穩定性。超高壓處理對蛋白的起泡性有促進作用，加熱處理對泡沫穩定性有促進作用。與對照組相比，加熱和超高壓都能促進持水、持油力，100℃加熱處理的菜籽蛋白持水力提高144.67%，600 MPa處理的菜籽蛋白持油力提高201.81%。圓二色譜分析得出不同pH條件下不同處理菜籽蛋白的二級結構變化差異大，100℃加熱處理對二級結構的影響顯著(P<0.05)。研究認為，超高壓和加熱處理都能改善菜籽蛋白的功能性質，對于菜籽蛋白的產業化應用具有實際意義。