D-氨基半乳糖修飾對玉米醇溶蛋白結構性質及生物活性的影響

曲 悅，王曉杰，劉曉蘭，叢萬鎖

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院, 黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

按照溶解性的不同，玉米中的蛋白質可以分為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白。其中，醇溶蛋白是玉米中蛋白質的主要成分，占玉米蛋白總量的50%～60%[1-2]。醇溶蛋白的氨基酸組成及其分子內存在的大區域α-螺旋結構，使之具有很強的疏水性，這一特性限制了玉米蛋白在食品工業的應用。為了使醇溶蛋白能夠應用于食品工業，需要對其進行改性處理。

目前，主要采用化學法對醇溶蛋白進行改性，包括磷酸化[3]、琥珀酰化[4]與美拉德糖基化[5-6]等方法。其中，美拉德糖基化是主要采用的改性方法。美拉德反應能夠在一定程度上改善醇溶蛋白的溶解性等功能特性，但是存在反應溫度高、反應時間長，有些產物會對人體產生致癌、致突變等毒害作用等缺點[7]。與美拉德反應相比，谷氨酰胺轉氨酶(TGase)催化的蛋白質與氨基糖之間的酶法糖基化反應具有反應特異性強、條件溫和、食用安全等優點，顯示出良好的應用優勢與前景。同時，蛋白質多肽鏈中糖基的引入，使得蛋白質的功能性，如溶解性、熱穩定性、凝膠性等得到顯著改善，甚至會增加某些蛋白質的抗氧化性、抑菌性和降低免疫原性等生理功能[8-12]。

玉米醇溶蛋白富含谷氨酰胺殘基，適合作為TGase的催化底物。在前期工作中，本課題組已經建立了D-氨基半乳糖糖基化修飾玉米醇溶蛋白的反應體系[13]，在此基礎上，本實驗以D-氨基半乳糖糖基化修飾的玉米醇溶蛋白為原料，研究糖基化修飾對玉米醇溶蛋白結構性質及生物活性的影響，為糖基化玉米醇溶蛋白在食品工業中應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米蛋白粉；D-氨基半乳糖，TGase(1 000 U/g)，菲洛嗪，5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2-脫氧-D-核糖，Sigma公司；其他試劑均為分析純。

DF-I集熱式磁力加熱攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；Q-20差示掃描量熱儀，美國TA儀器有限公司；DU800紫外可見分光光度計，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的制備

玉米醇溶蛋白的制備方法參照文獻[14]。玉米蛋白粉經擠壓膨化、去淀粉和脫色處理后，用70%乙醇萃取兩次。將兩次萃取液濃縮至有微小顆粒析出，冷凍干燥后獲得蛋白質含量為88.59%的玉米醇溶蛋白。

1.2.2 糖基化玉米醇溶蛋白的制備

糖基化玉米醇溶蛋白的制備方法參照文獻[13]。向玉米醇溶蛋白懸浮液中添加D-氨基半乳糖(酰基供體與酰基受體物質的量比為1∶3)，按60 U/g(以蛋白質量為基準)的加酶量添加TGase，在pH 7.5、37℃條件下進行糖基化反應10 h。反應結束后，85℃熱處理5 min，使反應體系中的TGase失活。冷卻至室溫，用截留相對分子質量為1 000 Da的透析袋于4℃透析48 h，每隔2 h換一次水，除去反應體系中未反應的D-氨基半乳糖。透析后的樣品經冷凍干燥后即為糖基化玉米醇溶蛋白。該糖蛋白的蛋白質含量為80.43%，糖含量為8.4%。同時，在上述體系中不加D-氨基半乳糖制備交聯玉米醇溶蛋白。

1.2.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物游離巰基含量的測定

采用Ellman’s分光光度法，參照文獻[14]測定玉米醇溶蛋白及其糖基化產物游離巰基含量。將0.030 0 g待測樣品與8 mL含有8 mol/L尿素的pH為8.0的Tris-Gly緩沖液混合，磁力攪拌下溶解1 h，離心收集上清液。取2 mL上清液，加入2 mL Tris-Gly緩沖液和40 μL Ellman’s試劑，混勻后反應1 h，在412 nm處測定吸光度，以不加樣品只加Ellman’s試劑為空白。游離巰基含量(S0)的計算公式如下：

式中：S0為游離巰基含量，μmol/g ；A412為412 nm吸光度；C為樣品蛋白質質量濃度，mg/mL；D為稀釋倍數。

1.2.4 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物熱穩定性的測定

精確稱取2.0 mg 待測樣品放入鋁盒中，壓蓋機壓蓋密封后置于DSC儀器的樣品支持器上，以密封空鋁盒作為對照。測定條件：氮氣壓力0.05 MPa，升溫速率10℃/min，溫度范圍20～190℃。

1.2.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的紅外光譜分析

稱取200 mg KBr粉末，除去其中的水分，充分研磨后壓片作為空白對照。另外取一份KBr，加入 1 mg 干燥的待測樣品，除去其中的水分，研磨后壓片，采用傅里葉紅外光譜儀測定波數為4 000～400 cm-1范圍內的紅外光譜，分辨率為4 cm-1。

1.2.6 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物抗氧化活性的測定

抗氧化活性的測定指標包括DPPH自由基清除活性、超氧陰離子自由基清除活性、羥基自由基清除活性和還原力，測定方法參照文獻[15]。其中，超氧陰離子自由基清除活性采用鄰苯三酚自氧化法，羥基自由基清除活性采用2-脫氧-D-核糖法。

1.2.7 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物乙醇脫氫酶激活率的測定

采用瓦勒-霍赫法[16]。將各種相應反應液加到試管中，混合后放入25℃的水浴鍋中，加蓋溫浴5 min后，立即向測定管中加入0.1 mL 0.25 U/mL乙醇脫氫酶(ADH)，搖勻后立即于340 nm處進行時間掃描，反應5 min，取反應最初的線性部分作圖，斜率記為Kp。對照管中用0.1 mL蒸餾水取代待測樣品，操作方法同測定管，記斜率為Kc。按下式計算ADH激活率。

1.2.8 數據統計及分析

本實驗所有數據均為重復實驗3次獲得，結果表示為“平均值±標準差”。采用Origin、IBM SPSS Statistics 19等數據處理軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白結構性質的影響

2.1.1D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白游離巰基含量的影響

游離巰基是形成二硫鍵的原體，是影響蛋白質三級結構的重要參數。因此，通過測定游離巰基含量的變化情況可以預測蛋白質在結構方面的變化程度。玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的游離巰基含量的測定結果如表1所示。

表1 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的游離巰基含量

注：表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可知，玉米醇溶蛋白中游離巰基含量為74.06 μmol/g，可能是由于二氧化硫浸泡過程將玉米醇溶蛋白分子中的部分二硫鍵還原為游離巰基，導致玉米醇溶蛋白本身具有較高的游離巰基含量。與玉米醇溶蛋白相比，雖然TGase催化的交聯反應使玉米醇溶蛋白的游離巰基含量顯著增加，但是糖基化反應使玉米醇溶蛋白的游離巰基含量顯著降低，可能的原因是糖基化過程中暴露出來的巰基發生了氧化反應或與二硫化物形成了分子內及分子間的二硫鍵。另外，與殼寡糖糖基化玉米醇溶蛋白相比，D-氨基半乳糖糖基化玉米醇溶蛋白的巰基含量下降的幅度較大，可能與D-氨基半乳糖的相對分子質量小而還原性強于殼寡糖有關[17]。

2.1.2D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白熱穩定性的影響

對玉米醇溶蛋白和糖基化產物進行DSC測定，以表征TGase催化的糖基化反應對玉米醇溶蛋白熱穩定性的影響，結果如圖1和表2所示。

圖1 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的DSC曲線表2 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的變性溫度和總變性焓

樣品變性溫度/℃總變性焓/(J/g)玉米醇溶蛋白108.52±2.54a162.45±8.98b交聯玉米醇溶蛋白112.08±0.91a160.60±11.31b糖基化玉米醇溶蛋白117.32±10.13a194.42±18.04a

由表2可知，酶法糖基化反應使玉米醇溶蛋白的變性溫度和總變性焓都發生了不同程度的上升，在整體上提高了玉米醇溶蛋白的熱穩定性。與玉米醇溶蛋白相比，糖基化反應使玉米醇溶蛋白的變性溫度提高8.8℃，總變性焓提高31.97 J/g。結合2.1.1中的實驗結果，說明D-氨基半乳糖的共價結合使玉米醇溶蛋白的結構變得更加有序，熱穩定性提高，這與殼寡糖糖基化的研究結果[17]及遲玉杰等[18]的研究結論相一致。但是，與玉米醇溶蛋白相比，交聯反應使玉米醇溶蛋白的變性溫度和總變性焓變化不顯著，說明在D-氨基半乳糖不存在的情況下，TGase催化的玉米醇溶蛋白分子間的交聯反應發生概率低。

2.1.3 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的紅外光譜

傅里葉紅外光譜是目前常用的一種分析糖蛋白結構的方法，用以判別糖蛋白分子上糖的特征吸收峰。采用傅里葉變換紅外光譜儀測定了玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的紅外光譜圖，結果如圖2所示。

圖2 玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的紅外光譜圖

由圖2可知，與玉米醇溶蛋白相比，糖基化玉米醇溶蛋白在1 145～1 000 cm-1范圍內明顯不同，而在此范圍內，玉米醇溶蛋白和交聯玉米醇溶蛋白基本沒有差異，說明交聯反應沒有顯著影響玉米醇溶蛋白基團的振動。在1 200～1 000 cm-1間比較大的吸收峰主要由兩種C—O伸縮振動引起，一種是C—O—H，一種是糖環的C—O—C，說明糖基化產物中有糖環的特征吸收峰[19]。 1 080～1 025 cm-1處的峰是環狀COH、COC和CH2OH的C—O伸縮振動區[20]。糖基化玉米醇溶蛋白在1 030 cm-1處的伸縮振動顯著增強，說明糖基化玉米醇溶蛋白含有更多的C—OH，進一步說明在TGase的催化下，D-氨基半乳糖與玉米醇溶蛋白之間發生了共價結合。

以上結構性質的研究結果表明，在D-氨基半乳糖不存在的反應體系中，TGase催化的玉米醇溶蛋白分子間的交聯反應發生的概率低，對玉米醇溶蛋白的結構性質影響較小。另外，在前期的研究中，已經證實交聯玉米醇溶蛋白的抗氧化活性與玉米醇溶蛋白之間沒有顯著性差異(P>0.05)[21]。因此，在下面的實驗中，僅以玉米醇溶蛋白為對照，測定D-氨基半乳糖的共價結合對玉米醇溶蛋白抗氧化活性的改善程度。

2.2 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白抗氧化活性的影響

2.2.1 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基是一種高穩定性的自由基，常被用于表征物質的抗氧化活性。以玉米醇溶蛋白為對照，測定糖基化玉米醇溶蛋白對DPPH自由基的清除能力，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著樣品質量濃度的增加，玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的DPPH自由基清除率逐漸增大，且糖基化產物清除DPPH自由基的能力高于玉米醇溶蛋白。在質量濃度為1.25 mg/mL時，糖基化玉米醇溶蛋白的DPPH自由基清除率為59.09%，比玉米醇溶蛋白高9.09個百分點。通過EC50(半最大效應濃度)值的計算，玉米醇溶蛋白及其糖基化產物清除DPPH自由基的EC50值分別為1.25 mg/mL和1.15 mg/mL，說明糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白對DPPH自由基的清除能力，可能是由于D-氨基半乳糖可以向DPPH自由基提供氫原子，使其成為穩定的DPPH-H分子導致的。

圖3 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白DPPH自由基清除率的影響

2.2.2 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白羥基自由基清除率的影響

羥基自由基具有很強的氧化能力，幾乎可以和所有的生物大分子物質(如蛋白質、核酸、脂肪等)反應，使生物大分子發生嚴重損壞，造成嚴重的細胞學后果。因此，對于抗氧化劑來說，具有清除羥基自由基的能力非常重要。分別測定玉米醇溶蛋白及其糖基化產物對羥基自由基的清除能力，結果如圖4所示。

圖4 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白羥基自由基清除率的影響

由圖4可知，雖然玉米醇溶蛋白本身具有清除羥基自由基的能力，但能力較低，而D-氨基半乳糖的共價結合使玉米醇溶蛋白的羥基自由基清除能力顯著增加。在質量濃度為2.0 mg/mL時，糖基化玉米醇溶蛋白的羥基自由基清除率為26.74%，比玉米醇溶蛋白高16.85個百分點，進一步說明糖基化玉米醇溶蛋白是良好的氫供體，可以使高活性羥基自由基被還原。

2.2.3 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白超氧陰離子自由基清除率的影響

超氧陰離子自由基在氧化過程中最早產生，氧化性雖然相對較弱，但其可以形成羥基自由基等更強的活性氧自由基。因此，阻斷超氧陰離子自由基的產生可有效中斷整個自由基的反應鏈。分別測定玉米醇溶蛋白及其糖基化產物對超氧陰離子自由基的清除率，結果如圖5所示。

圖5 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白超氧陰離子自由基清除率的影響

由圖5可知，隨著樣品質量濃度的升高，玉米醇溶蛋白和糖基化玉米醇溶蛋白的超氧陰離子自由基清除率均呈現逐漸增大的趨勢，且在相同質量濃度下，糖基化玉米醇溶蛋白的超氧陰離子自由基清除能力高于玉米醇溶蛋白。在質量濃度為2.0 mg/mL時，糖基化玉米醇溶蛋白的超氧陰離子自由基清除率為15.16%，比玉米醇溶蛋白高4.43個百分點，說明糖基化玉米醇溶蛋白分子中具有抗氧化活性的氨基酸與D-氨基半乳糖的伯、仲 —OH的協同作用，使鄰苯三酚在自氧化初期產生的超氧陰離子自由基形成穩定的分子，從而有效中斷整個自由基的反應鏈。

2.2.4 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白還原力的影響

樣品還原能力的強弱可以反映抗氧化性的強弱。分別測定玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的還原力，結果如圖6所示。

圖6 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白還原力的影響

由圖6可知，玉米醇溶蛋白具有一定的還原力，且還原力與樣品質量濃度之間呈正相關。在質量濃度為2.0 mg/mL時，玉米醇溶蛋白的還原力為0.154。與玉米醇溶蛋白相比，經D-氨基半乳糖的共價結合后玉米醇溶蛋白的還原力增加，可能是因為糖基化修飾產物既是良好的氫供體，也是良好的電子供體，可以向Fe3+提供電子，將其還原成Fe2+，使普魯士藍的生成量增加，700 nm處吸光度升高，糖基化樣品的還原力增強[17]。

2.3 糖基化修飾對玉米醇溶蛋白乙醇脫氫酶激活率的影響

肝臟中乙醇脫氫酶活力是乙醇代謝的關鍵。因此，糖基化產物的乙醇脫氫酶活力是其發揮促酒精代謝的重要指標。分別測定玉米醇溶蛋白及其糖基化產物的乙醇脫氫酶激活率，以表征樣品的體外促酒精代謝活性，結果如圖7所示。

圖7 D-氨基半乳糖糖基化修飾對玉米醇溶蛋白乙醇脫氫酶激活率的影響

由圖7可知，在質量濃度小于1.0 mg/mL時，玉米醇溶蛋白無乙醇脫氫酶的激活活性，在質量濃度為2.0 mg/mL時，玉米醇溶蛋白的乙醇脫氫酶激活率也僅為1.56%。與玉米醇溶蛋白相比，糖基化修飾改善了玉米醇溶蛋白對乙醇脫氫酶的激活能力，在質量濃度為2.0 mg/mL時，糖基化產物的乙醇脫氫酶激活率為5.13%，比玉米醇溶蛋白高3.57個百分點，可能是D-氨基半乳糖的共價結合使玉米醇溶蛋白的溶解性增加，可以與乙醇脫氫酶非共價結合形成復合物，提高了乙醇脫氫酶反應速率，起到激活作用[22]。但是，在相同質量濃度下，D-氨基半乳糖修飾產物的乙醇脫氫酶激活率低于殼寡糖修飾產物，可能是因為殼寡糖是多糖，對玉米醇溶蛋白溶解性改善的程度強于D-氨基半乳糖導致的。

3 結 論

本實驗以含有伯胺基團的D-氨基半乳糖為酰基受體，通過TGase催化的糖基化反應修飾玉米醇溶蛋白，研究了糖基化反應對玉米醇溶蛋白結構性質及生物活性的影響。紅外光譜的測定結果表明，在TGase的催化下，玉米醇溶蛋白與D-氨基半乳糖發生了共價結合。與玉米醇溶蛋白相比，D-氨基半乳糖的共價結合使玉米醇溶蛋白的熱穩定性增強，抗氧化活性(包括DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基清除活性和還原力)和乙醇脫氫酶激活率顯著提高，但交聯反應對玉米醇溶蛋白的結構性質影響較小。在此基礎上，可以開展細胞實驗或動物實驗，進一步研究糖基化玉米醇溶蛋白的護肝活性。