高產油小球藻的低溫等離子體誘變育種

衛治金，李 曉，王皓楠，趙倩倩，于道永，葛保勝

(中國石油大學(華東) 生物工程與技術中心，山東 青島 266580)

化石燃料的大量使用使得能源危機和溫室效應問題日益突出，因此開發可再生、無污染的新型能源越來越受到人們的關注[1]。生物柴油作為化石能源的替代燃料，具有燃燒性好、穩定性高及含硫量低等特點，已成為目前國際上發展最快、應用最廣的可再生綠色能源[2]。

微藻作為一種新型生物質能源，具有生長周期短、生物產量高及占地面積小等特點[3]。微藻為光合自養生物，可以通過光合作用吸收大氣中的CO2，在緩解溫室效應的同時能夠生成蛋白質、葉綠素、油脂等物質[4]，被認為是生產生物柴油和生物產品最有希望的原料之一[5]。目前，國內外對微藻制備生物柴油做了許多基礎研究，但是微藻生物柴油的高成本制約了其規模化的生產[6]，而優良藻種的篩選是降低成本的首個關鍵環節。

目前，大多數優良藻種的選育一般采用物理、化學或生物學手段。其中物理誘變方法因污染小、操作簡便及安全性高，已成為工業微生物育種中最常用且最有效的技術。常用的物理誘變手段主要包括紫外線、X射線和離子束等[7]。然而常規誘變選育的藻株常存在突變效率低、突變譜窄并易產生抗性飽和等問題[8]。近年來，隨著等離子體交叉學科研究的快速發展，其在等離子體刻蝕、材料表面改性、消毒滅菌及微生物誘變育種等領域的研究深受關注[9]。低溫等離子體是指在低溫狀態下，利用外加電壓將氣體分子擊穿，產生包括電子、離子、原子和自由基在內的混合體，這些物質能與生物體內大分子發生相互作用，從而引起各種各樣的變異[10]。王純陽等[11]通過研究低溫等離子體對水稻種子生長的影響，表明低溫等離子體對水稻糙米種子的生長活力具有促進作用。桂芳等[9]利用低溫空氣等離子體對產黃青霉菌進行誘變育種，正突變率高達44.19%，同時青霉素效價較出發菌提高了42.1%。金麗華等[12]利用等離子體快速誘變產油酵母使得突變株產油量較原始株提高了2.2倍，生物量也提高了1.5倍，而低溫等離子體技術應用于微藻誘變育種的相關研究報道較少。

本研究以小球藻(Chlorellavulgaris)為研究對象進行低溫等離子體誘變，測定培養過程中的生物量、油脂含量等指標，旨在篩選獲得生長速度快且油脂含量高的藻株，以期為實現微藻生物柴油的規模化生產提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種及培養基

小球藻(C.vulgaris)，中國科學院武漢水生生物研究所；BG11培養基。

1.1.2 主要試劑

正己烷、硫酸、氯仿、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)，索萊寶公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白(BSA)，天根生化科技有限公司；尼羅紅染料，Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀，UV-1700紫外分光光度計，GXZ恒溫光照培養箱，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，5810R臺式冷凍離心機，Fluoro Max-4熒光光譜儀，KQ-100KDE超聲波清洗器，CTP-2000K低溫等離子體實驗電源。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種培養

取藻液接種于含有40 mL BG11液體培養基的100 mL三角瓶中，接種量20%，置于恒溫光照培養箱中培養，培養溫度25℃，光照周期為光14 h/暗10 h，光照強度210 μmol/(m2·s)。

1.2.2 低溫等離子體誘變預實驗

取培養至對數生長期的小球藻藻液，用無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)調整OD750至0.2，制成懸浮液[13]。取5 mL藻懸液，在低溫等離子體實驗電源電壓40 kV、電流2 A放電條件下分別誘變照射1、2、3、4、5 min，然后置于暗環境培養24 h，取100 μL藻液涂布于BG11固體平板上，光暗交替培養(培養條件同1.2.1)，7 d后根據培養基上生長的藻落數計算致死率，確定適合的誘變時間。

1.2.3 低溫等離子體誘變實驗

根據1.2.2預實驗中確定的誘變參數對野生株小球藻進行誘變后，光暗交替培養7 d，挑取體積較大、顏色濃綠的單克隆藻株，接種于BG11液體培養基中并置于恒溫光照培養箱中光暗交替培養(培養條件同1.2.1)。以油脂含量為指標，篩選誘變藻株。同時，以野生藻株為對照，對誘變株的各項生理生化指標進行測定。

1.2.4 生物量的測定

用烘干稱重法測定。取一定體積的藻液，8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥置于預先干燥稱重的離心管中，70℃烘箱烘干恒重，冷卻后稱量，設置3個平行樣。生物量(DCW)以單位體積的藻液中藻細胞干重表示。

1.2.5 葉綠素含量的測定

用96%甲醇提取法測定。取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入10 mL 96%甲醇，渦旋混勻3 min后超聲浸提40 min，期間避光加冰防止葉綠素受熱見光分解。待藻體顏色變白，離心取上清液，用紫外分光光度計測得OD653和OD666，根據下式計算葉綠素含量[14]。同時，計算葉綠素產率(以單位培養時間、單位體積的藻液中葉綠素增加的質量表示)。

Ca=15.65×OD666-7.34×OD653

Cb=27.05×OD653-11.21×OD666

Ca+b=(Ca+Cb)/(10DCW)

式中：Ca為藻液中葉綠素a的質量濃度，mg/L；Cb為藻液中葉綠素b的質量濃度，mg/L；Ca+b為藻細胞中葉綠素a與葉綠素b的含量，%；DCW為藻細胞干重，g/L。

1.2.6 蛋白質含量的測定

用Bradford法測定[15]。以牛血清蛋白(BSA)為標樣，繪制蛋白質量濃度與OD595的標準曲線。

取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入2 mL PBS(pH 7.2)，渦旋混勻3 min后進行超聲破碎，待藻體澄清，離心，取適當體積的上清液用PBS補足至150 μL后加入2.85 mL考馬斯亮藍，混勻，室溫放置5 min后測定OD595。根據標準曲線計算蛋白質含量。同時，計算蛋白質產率(以單位培養時間、單位體積的藻液中蛋白質增加的質量表示)。

1.2.7 總脂含量的測定

用氯仿-甲醇法測定[16]。取干燥的藻粉于10 mL離心管中，加入3 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)，渦旋混勻3 min后超聲浸提40 min，8 000×g離心15 min收集上清至已稱重的玻璃試管中，沉淀繼續用氯仿-甲醇溶液萃取至無色，最后合并上清，用氮氣將玻璃試管中的有機溶劑吹干，并置于60℃烘箱干燥3 h，冷卻后稱重，計算總脂含量和總脂產率(以單位培養時間、單位體積的藻液中總脂增加的質量表示)。

1.2.8 中性脂含量的測定

用尼羅紅(NR)熒光染色法測定[17]。取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入20% DMSO懸浮，然后用紫外分光光度計調節OD540至1.0[18]，同時通過干重法測定該藻液的生物量。取2 mL調節好OD540的藻液，40℃水浴30 min后加入10 μL 0.24 mg/mL尼羅紅染料，避光染色5 min 后用熒光光譜儀以520 nm為激發波長，574 nm 為消散波長測定熒光強度，根據標準曲線換算成中性脂含量。同時，計算中性脂產率(以單位培養時間、單位體積的藻液中中性脂增加的質量表示)。

1.2.9 脂肪酸組成及含量的測定

取1.2.7過程中獲得的總脂，加入0.4 mL 50%硫酸和2 mL無水甲醇，混勻封口，60℃水浴30 min后加入1 mL正己烷，混勻離心取上清。以正十九酸為內標，進行氣相色譜分析[19]。根據樣品中各組分保留時間定性，采用面積歸一化法定量。

氣相色譜條件：HP-5毛細管色譜柱；進樣口溫度280℃；檢測器溫度300℃；柱溫50℃，保持2 min，以10℃/min升溫至280℃，保持10 min；載氣為氮氣，流速2.3 mL/min；分流比3∶1；進樣量1 μL。

2 結果與討論

2.1 低溫等離子體誘變時間的確定及誘變藻株的篩選

用低溫等離子體誘變處理野生型小球藻后，藻液顏色由深綠色變淺甚至變白，誘變時間越長，顏色越淺。誘變培養7 d后統計藻細胞誘變致死率，結果見圖1。

圖1 不同低溫等離子體誘變時間的致死率

由圖1可見，等離子體誘變4 min的致死率為83%，誘變5 min的致死率為91%，表明低溫等離子體能在短時間內造成微藻細胞的突變，從而產生較為明顯的誘變效果。根據80%～90%的致死率為最適誘變劑量，選擇4 min為本實驗的誘變時間。通過對野生型小球藻進行誘變共得到1 000株誘變株，以BG11培養基進行篩選得到3株油脂含量較高的藻株，分別命名為M1、M4和M7，對這3株誘變株的各項生理生化指標進行測定。

2.2 誘變株生物量的變化(見圖2)

圖2 誘變株及野生株生物量的變化

由圖2可見，藻株培養10 d，3株誘變株生物量較野生株發生了改變，誘變株M1的生物量積累最高，為0.22 g/L，較野生株的0.17 g/L增加了29.4%，誘變株M4和M7生物量積累次之，分別為0.19 g/L和0.20 g/L，較野生株分別增加了11.8%和17.6%。該結果說明3株誘變株的生長速率較野生株有了一定程度的提高。

2.3 誘變株葉綠素含量及產率的變化(見圖3)

圖3 誘變株及野生株培養10 d葉綠素含量及產率的變化

由圖3可見，誘變株M1、M4和M7的葉綠素含量分別為12.74%、12.94%和13.27%，較野生株的14.39%均有一定程度的降低。分析原因可能是低溫等離子體誘變致使藻細胞內部分原料物質流向合成油脂等組分的比例增高，從而使得細胞內葉綠素含量降低。誘變株M1和M7的葉綠素產率分別為2.80、2.65 mg/(L·d)，較野生株的2.45 mg/(L·d)分別提高了14.3%和8.2%，而誘變株M4則無顯著變化。誘變株M1和M7的葉綠素含量降低，但2株誘變株生物量增高明顯，因此其葉綠素產率也有了一定程度的提高。

2.4 誘變株蛋白質含量及產率的變化

微藻細胞蛋白質含量豐富，能夠為人和動物提供所必需的氨基酸，可用作食品和動物飼料添加劑[20]，因此對培養過程中各藻株蛋白質含量及產率進行測定，結果見圖4。

圖4 誘變株及野生株培養10 d蛋白質含量及產率的變化

由圖4可見，誘變株M1的蛋白質含量為31.22%，較野生株的27.11%提高了15.2%，其余2株誘變株蛋白質含量則略有降低。3株誘變株的蛋白質產率均有一定程度的提高，其中M1和M7的蛋白質產率分別為6.87 mg/(L·d)和5.34 mg/(L·d)，較野生株的4.61 mg/(L·d)分別提高了49.0%和15.8%。

2.5 誘變株總脂含量及產率的變化(見圖5)

由圖5可見，3株誘變株的總脂含量較野生株均有明顯的提高，誘變株M1、M4和M7的總脂含量分別為37.28%、24.83%和27.11%，較野生株的18.32%分別提高了103.5%、35.5%和48.0%。誘變株M1的總脂產率最高，為8.20 mg/(L·d)，較野生株的3.11 mg/(L·d)提高了163.7%，誘變株M4和M7的總脂產率也較野生株分別提高了51.8%和74.3%。該結果說明低溫等離子體誘變篩選的3株藻株油脂含量均有較為顯著的提高。

圖5 誘變株及野生株培養10 d總脂含量及產率的變化

2.6 誘變株中性脂含量及產率的變化

微藻生物柴油生產過程中的轉酯化反應主要是微藻細胞中的甘油三酯即中性脂與甲(乙)醇反應生成脂肪酸甲(乙)酯，后者為生物柴油的主要成分。而大多數海洋微藻的主要脂類為極性脂，中性脂更多的是以儲存脂質的形式存在。因此，提高微藻細胞內中性脂含量對微藻制備生物柴油具有重要意義。對3株誘變株的中性脂含量及產率進行了測定，結果見圖6。

圖6 誘變株及野生株培養10 d中性脂含量及產率的變化

由圖6可見，3株誘變株的中性脂含量較野生株均有明顯的提高，其中誘變株M1的中性脂含量最高，為19.12%，較野生株的8.19%提高了133.5%，誘變株M4和M7也分別提高了30.3%和39.9%。誘變株M1的中性脂產率最高，為4.21 mg/(L·d)，較野生株的1.39 mg/(L·d)提高了202.9%；誘變株M4和M7的中性脂產率也分別提高了45.6%和64.7%。以上結果說明，誘變株M1的中性脂含量及產率均有顯著的提高，具有一定的產業化應用潛力。

2.7 誘變株脂肪酸組成及含量的變化

微藻油脂中含有多種形式的脂肪酸成分，包括飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)。其中MUFA的十八烯酸C18∶1為生物柴油的指標[21]，PUFA中的EPA和DHA組分對人體具有很高的營養學和藥學價值。因此，提高微藻細胞內具有經濟價值脂肪酸的含量對生產生物柴油及生物產品具有重要意義。

對培養10 d的3株誘變株及野生株的油脂脂肪酸組成及含量進行測定，結果見表1。

表1 誘變株及野生株油脂脂肪酸組成及含量 %

由表1可見，C16與C18脂肪酸在誘變株M1、M4和M7中的含量分別為80.8%、66.5%和67.9%，高于野生株的62.8%，而這兩種脂肪酸是生物柴油的主要組分。同時作為生物柴油指標的十八烯酸C18∶1在3株誘變株中的含量分別為27.7%、22.8%和20.9%，較野生株分別提高了64.9%、35.7%和24.4%。3株誘變株MUFA含量為37.4%～44.0%，PUFA含量為15.4%～19.8%，均高于野生株的35.6%和14.9%，而SFA含量有所下降。誘變株M1藻細胞油脂PUFA中的亞油酸C18∶2和α-亞麻酸C18∶3含量也均有所提高，前者在人體內被吸收利用最終生成花生四烯酸，后者在人體內則會轉化生成EPA和DHA，EPA能降低人體血液黏稠度，促進血液循環，而DHA能促進人體大腦的成長和發育。以上結果表明3株誘變株中飽和脂肪酸含量降低，而不飽和脂肪酸含量有所提高，這對微藻生物柴油的制備及生物產品的加工具有重要意義。

3 結 論

本文以小球藻(C.vulgaris)為研究對象進行低溫等離子體誘變，測定培養過程中生物量、油脂含量和脂肪酸組成等指標，旨在篩選具有產業化潛力的能源藻株。結果表明，誘變篩選得到3株油脂含量高且生物量高的藻株，其中最具產業化潛力藻株M1的總脂含量、中性脂含量、總脂產率及中性脂產率分別為37.28%、19.12%、8.20 mg/(L·d)和4.21 mg/(L·d)，較野生株分別提高了103.5%、133.5%、163.7%和202.9%，M1的生物量及蛋白質含量分別為0.22 g/L和31.22%，較野生株也有一定程度的提高。誘變株M1藻細胞中的MUFA和PUFA 含量分別為44.0%和19.8%，高于野生株的35.6%和14.9%；MUFA中作為生物柴油指標的C18∶1組分含量為27.7%，較野生株的16.8%提高了64.9%；同時PUFA中的亞油酸C18∶2和α-亞麻酸C18∶3含量也均有所提高。

致謝：本文中低溫等離子體誘變實驗在中科院合肥物質研究院離子束生物工程實驗室進行，感謝課題組成員對本研究提供技術和實驗指導。