膠質母細胞瘤中HOXD10基因啟動子的甲基化檢測及與預后的關系*

李明軒，方琪星，任虹宇，司昊天，馬建功，王曉彬，張小廣，方樹民，何 承

河南大學第一附屬醫院 神經外科(開封 475000)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，包括膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)、星形細胞瘤、室管膜瘤等類型，其中GBM的惡性程度最高[1]。GBM以手術切除為主，輔助放、化療等綜合治療。目前，GBM患者的生存率和生存質量依然較低[2]，探索治療GBM的新思路或新方法一直是研究的難點和重點。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳變化，可影響DNA與其他分子的相互作用，與基因沉默、細胞正常功能的維持、腫瘤的發生和發展等關系密切。研究[3]發現，DNA異常甲基化還可用于預測腫瘤復發、轉移以及作為分子標記物評估腫瘤患者預后。同源盒(homeobox，HOX)基因是一類同源異性基因，除能夠調控正常細胞發育、分化外，在組織細胞增殖和侵襲中也發揮關鍵調節作用[4]。HOX D10基因是HOX家族成員之一，其表達水平與結直腸癌、胃癌、膽管癌等多種惡性腫瘤的惡性程度關系密切，參與腫瘤的發生和發展過程[5-7]。目前，GBM中HOXD10基因啟動子甲基化的狀態研究還未有報道。本研究通過檢測GBM患者HOXD10基因啟動子的甲基化狀態，分析其與患者預后的相關性，以期為GBM的預后評估提供一定的理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集河南大學第一附屬醫院2015年8月至2017年9月經確診并行手術治療的49例GBM標本，其中男25例，女24例，年齡26～81(58.63±8.49)歲。術前均未行放、化療等治療，患者臨床資料完整，病理診斷明確。腫瘤組織按《WHO中樞神經系統腫瘤分類(2007)》病理分級，Ⅰ級10例，Ⅱ級9例，Ⅲ級13例，Ⅳ級17例。另選取30例正常腦組織標本(腦外傷組織、內減壓腦組織等)作為對照，其中男15例，女15例，年齡28～80(60.27±9.51)歲。兩組在性別、年齡等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經河南大學第一附屬醫院倫理委員會批準同意。受試者知情并自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和實驗儀器

DNeasy Tissue Kit試劑盒，美國Sigma公司；DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；CpGenome TM DNA Modification Kit試劑盒，美國Merck Millipore公司；Wizard Clean up DNA純化試劑盒，美國Promega公司；HOXD10基因啟動子甲基化PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鼠抗人HOXD10單克隆抗體，英國Abcam公司；生物素標記的羊抗鼠IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司。超微量分光光度計，美谷分子儀器(上海)有限公司；顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3 特異性PCR檢測HOXD10基因啟動子甲基化

取組織標本，按照D Neasy Tissue Kit試劑盒操作說明提取DNA。超微量分光光度計檢測提取的DNA純度和濃度。DNA樣本在260 nm和280 nm處的吸光度的比值>1.8時可用于后續實驗。然后按照CpGenomeTMDNA Modification Kit試劑盒操作說明對提取的DNA 進行修飾。DNA修飾后對其進行純化，具體操作參照Wizard Clean up DNA純化試劑盒操作說明。純化后的DNA重懸于超純水中，-20 ℃保存備用。采用PCR技術對純化后的DNA進行擴增。HOXD10甲基化上游引物5'-TTATTTATGGGGATTCGGGTTC-3'，下游引物5'-AAAAAAACCGAATCCAAAAC AAACG-3'；非甲基化上游引物5'-ATTTAT TTATGGGG-ATTTGGGTTT-3'，非甲基化下游引物5'-AAAAAAACCAAATCCAAACAAACA-3'。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，經40個循環后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于凝膠成像系統觀察結果。以無菌超純水代替DNA作為空白對照。甲基化結果判斷：M有特異產物，而U無產物，為完全甲基化陽性；M和U兩者都有特異產物，為部分甲基化陽性；如果U有特異產物，而M無產物，為甲基化陰性。完全甲基化陽性和部分甲基化陽性均記為甲基化陽性。

1.4 免疫組織化學法檢測HOXD10蛋白表達

組織標本經常規脫蠟處理、梯度乙醇水化、抗原修復后，置于pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱至沸騰，冷卻，PBS清洗。封閉10 min，滴加HOXD10抗體(稀釋比1∶800)，4 ℃孵育12 h。PBS代替HOXD10抗體作用陰性對照。孵育后洗滌，滴加生物素標記的IgG抗體(稀釋比1∶100)，4 ℃孵育20 min。之后再滴加辣根酶標記鏈酶卵白素，4 ℃孵育20 min。孵育后PBS洗滌，滴加DAB顯色液，染色5 min。經沖洗、蘇木精復染、脫水、封片后顯微鏡下觀察。HOXD10蛋白表達陽性細胞呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞核。從每張切片中隨機挑選5個高倍視野，統計陽性染色細胞數量。1)按陽性細胞占百分比計分，<5%記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>76%記為4分；2)按染色強度計分為，無色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。取上述兩項結果的乘積：≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。

1.5 隨訪

對患者進行隨訪，時間1年，記錄患者手術之日起至腫瘤復發、轉移或死亡時間。末次隨訪時間截至2018年9月。無進展生存期(progression free survival，PFS)即患者手術之日起至腫瘤復發、轉移或殘留腫瘤復發生長為止?？偵嫫?overall survival，OS)，即手術之日起至患者死亡為止。對于無復發、轉移或死亡的患者，PFS和OS以末次隨訪時間計算。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 兩組HOXD10啟動子甲基化狀態比較

GBM和正常腦組織HOXD10啟動子甲基化陽性率分別為65.31%(32/49)、23.33%(7/30)。與正常腦組織相比，GBM中HOXD10啟動子甲基化陽性率升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 GBM中HOXD10啟動子甲基化狀態

2.2 HOXD10啟動子甲基化狀態與患者臨床病理特征關系

HOXD10啟動子甲基化狀態與患者性別、年齡、Karnofsky功能狀態評分標準(KPS評分)無關(P>0.05)。腫瘤直徑>5 cm患者的HOXD10啟動子甲基化陽性率高于腫瘤直徑≤5 cm患者(P<0.05)，病理分級為高級別(Ⅲ～Ⅳ級)患者HOXD10啟動子甲基化陽性率高于病理分級為低級別患者(P<0.05)(表1)。

表1 HOXD10啟動子甲基化狀態與患者臨床病理特征關系

2.3 HOXD10啟動子甲基化狀態與患者預后關系

Kaplan-Meier法分析HOXD10啟動子甲基化狀態與GBM患者預后(PFS、OS)的關系。結果顯示，GBM中HOXD10啟動子甲基化陽性患者PFS(21.88%)、OS(9.38%)均低于陰性患者PFS(70.59%)、OS(47.06%)(P<0.05)(圖2)。

圖2 HOXD10啟動子甲基化狀態與患者預后關系注：A：PFS曲線；B：OS曲線

2.4 Cox比例風險模型分析影響患者預后因素

病理分級和HOXD10基因啟動子甲基化狀態是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05)(表2)。

表2 Cox分析影響患者預后因素

2.5 HOXD10蛋白表達比較

免疫組化染色結果顯示，正常腦組織和GBM中HOXD10蛋白陽性率分別為76.67%(23/30)、36.73%(18/49)，兩者差異有統計學意義(P<0.05)。GBM中HOXD10基因啟動子甲基化陽性患者HOXD10蛋白陽性率為12.50%(4/32)，甲基化陰性患者HOXD10蛋白陽性率82.35%(14/17)，兩者差異有統計學意義(P<0.05)。Spearman相關性分析結果顯示，GBM中HOXD10基因啟動子甲基化與其蛋白表達呈負相關(r=-0.731，P<0.05)(圖3)。

圖3 HOXD10蛋白在GBM中表達(×200)

注：A：GBM中HOXD10蛋白陽性；B：GBM中HOXD10蛋白陰性

3 討論

膠質瘤約占顱內原發性惡性腫瘤的70%，是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤。GBM患者人數在膠質瘤中占比約50%，危害性極強，嚴重威脅患者生命健康[8]。隨著醫療水平的不斷提高，膠質瘤的治療手段有了很大的改善，但目前患者的中位生存期依然較短[9]，預后不佳，對該疾病病因及預后影響因素的探索具有重要意義。

HOXD10基因位于2號染色體p31位點，可調控細胞生長、發育，抑制細胞外基質重塑和遷移相關基因的表達，在多種腫瘤中表達異常。Sekar等[10]研究發現，乳腺癌組織中 HOXD10基因表達下調，與腫瘤組織學分級相關，腫瘤等級越高，其表達水平越低，提示HOXD10基因在乳腺癌中發揮重要的腫瘤抑制作用，其喪失會促進導致乳腺癌的發展。李民等[11]研究發現，人腦膠質瘤中HOXD10 mRNA和蛋白均較正常腦組織表達降低，與膠質瘤惡性程度呈負相關。本研究結果顯示，膠質母細胞瘤中HOXD10 mRNA和蛋白較正常腦組織降低，與相關報道結果一致。而頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)中HOXD10表達水平升高，HOXD10敲低可抑制HNSCC細胞中增殖和侵襲減少，可作為HNSCC預后評估的參考指標，這可能與腫瘤細胞類型不同有關。

DNA甲基化在調節機體生物學過程中發揮重要作用。DNA甲基化可抑制基因轉錄，造成基因沉默[12]。DNA甲基化造成的抑癌基因活性喪失也是腫瘤發生、發展的重要作用機制之一[13]。研究發現，HOXD10基因啟動子在多種腫瘤中甲基化狀態異常。楊海霞等[14]研究發現，膽管癌組織中HOXD 10基因啟動子甲基化率較癌旁組織明顯升高，且癌組織中HOXD10基因啟動子甲基化與HOXD10蛋白表達呈負相關，HOXD10基因啟動子區存在CpG位點甲基化個數≥7時可用作膽管癌患者預后不良的參考指標。Lin等[15]研究發現，胃癌患者血液中HOXD10甲基化率明顯增加，且HOXD10甲基化與幽門螺桿菌狀態，血清CA19-9和CEA水平及腫瘤浸潤深度有關，HOXD10啟動子高甲基化可能是胃癌早期診斷和病情監測的生物標記物。但是GBM中HOXD10基因啟動子是否甲基化尚未有報道。本研究結果顯示，GBM中HOXD10基因啟動子甲基化陽性率高于正常腦組織，且患者病理分級越高，腫瘤直徑越大，HOXD10基因啟動子甲基化陽性率越高，提示HOXD10基因啟動子甲基化參與GBM的發生、發展，與該疾病惡性程度密切相關。HOXD10基因啟動子甲基化陽性患者PFS和OS低于陰性表達患者，是影響GBM患者預后的獨立危險因素，提示患者HOXD10基因啟動子甲基化陽性與患者預后不良相關，可作為患者預后評估的重要生物分子指標。同時，HOXD10基因啟動子甲基化趨勢與免疫組織化學法檢測的HOXD10蛋白表達相反，相關性分析結果顯示二者表達呈明顯負相關，說明HOXD10基因啟動子甲基化造成其蛋白表達沉默。

綜上所述，GBM中HOXD10基因啟動子甲基化陽性率上調，其陽性表達患者PFS和OS低于陰性表達患者，檢測HOXD10基因啟動子甲基化狀態有助于評估患者預后。