長鏈非編碼RNA PTV1通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲及誘導凋亡

鐘麗穎，李順東，孫葉海

長沙市第三醫(yī)院 老年病科 (長沙 410015)

甲狀腺癌(thyroid cancer, TC)是內分泌系統中最常見的惡性腫瘤，約占所有癌癥的1%[1]。TC可分為乳頭狀、濾泡狀、髓質狀和間變性亞型，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，占75%～85%[2-3]。盡管TC的5年生存率可以達到95%，但是仍有部分PTC患者預后較差[4]。因此，探索PTC惡性進展過程中的分子機制、尋找新的、有效的治療靶點對防治PTC具有重要意義。近年的研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)在胃癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8]及甲狀腺癌[9]等多種腫瘤中異常表達，且參與腫瘤的生長、侵襲轉移等生物學過程。本研究旨在探討LncRNA-PVT1對PTC細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人正常甲狀腺細胞株HT-ori3(北納創(chuàng)聯生物技術有限公司)及人甲狀腺癌細胞株IHH-4(PTC)、FTC-133、8505C購自中國科學院上海細胞生物研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司，美國)；1%青霉素-鏈霉素(南京碧云天公司，中國)；CCK-8試劑盒和凋亡檢測試劑盒(同仁公司，日本)；Transwell小室(Corning公司，美國)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒(Sigma，美國)；PVT1引物、PVT1-siRNA及陰性對照載體(上海生工，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 分別將HT-ori3(n=6)、IHH-4(n=6)、FTC-133(n=6)及8505C(n=6)細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 按照試劑盒操作說明，使用Trizol法提取細胞總RNA，并使用反轉錄試劑盒進行cDNA合成。以cDNA模板進行PCR擴增，以GAPDH為內參進行熒光定量PCR。所用引入序列為：LncRNA-PTV1上游5'-TGAGAACTGTCCTT ACGTGACC-3'，下游5'-AGAGCACCAAG ACTGGCTCT-3'；GAPDH上游5'-GGGTGGAG CCAAACGGGTC-3'，下游5'-GGAGTTGCT GTTGAAGTCGCA-3'。 采用熒光定量PCR儀Mx3006P進行定量檢測，目的基因的定量分析采用 2-△△Ct方法進行計算。

1.2.3 細胞轉染 根據qRT-PCR結果選擇PTC細胞進行后續(xù)實驗。取對數生長期的PTC細胞接種于6孔板，接種密度為3.0×105個/孔，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至80%時進行轉染實驗。將PCT細胞隨機分為3組，按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進行轉染操作，分別轉染PTV1-siRNA沉默載體(PTV1-siRNA組，n=6)、PTV1-siRNA空表達載體(siNC組，n=6)及空白對照PBS(Blank組，n=6)。轉染48 h，qRT-PCR檢測轉染效率，其方法參照1.2.2實驗步驟。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖 取對數生長期的IHH-4細胞，胰酶消化成單細胞懸液，以3×103個/孔接種于96孔板中，每組設置6個復孔，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種后24、48和72 h加入CCK-8溶液(5 g/L)，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于450 nm處使用酶標儀測定各孔細胞的吸光度(OD)值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞轉染48 h后，收集各組細胞并用預冷的PBS洗滌，加入100 μL結合緩沖液(binding buffer)重懸細胞，再分別加入用熒光抗體FITC標記的磷脂結合蛋白V試劑盒(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium lodide)各5 μL，輕輕混勻后避光室溫孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 細胞遷移侵襲(Transwell)實驗 收集各組轉染細胞重新懸浮于無血清培養(yǎng)基中，取細胞懸液接種于Transwell 的上室，接種密度為5×104個/孔，在小室下層孔中加入750 μL含血清的培養(yǎng)液，將Transwell小室置入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，小心拭去未穿透的細胞及Matirgel膠，4%甲醛固定，結晶紫染色。在顯微鏡下(40×)計數5個單獨視野的穿膜細胞數。

1.2.7 蛋白質印跡技術(Western Blot)檢測蛋白表達水平 細胞轉染培養(yǎng)48 h后，收集細胞并使用細胞裂解液(RIPA)進行裂解，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白含量。根據蛋白濃度檢測結果，取20 μL 蛋白樣品進行 Western blot 檢測。配制10% SDS-PAGE分離膠，利用 5% 的脫脂奶粉封閉液室溫下封閉 2 h，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗孵育 1 h，ECL顯影，拍照后計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PTV1在甲狀腺癌細胞株中的表達情況

qRT-PCR檢測結果顯示，與正常甲狀腺細胞株相比，甲狀腺癌細胞株IHH4(PTC)、FTC133、8505C中PTV1表達水平明顯升高，且IHH-4中PTV1表達水平明顯高于FTC133和8505C，差異具有統計學意義(F=98.59，P<0.001)(圖1)。

圖1 LncRNA PTV1在甲狀腺癌細胞株中的表達

注：與HT-ori3相比較，*P<0.05；與IHH-4相比較，#P<0.05

2.2 qRT-PCR檢測轉染效率

轉染48 h后，qRT-PCR檢測結果顯示：si-PTV1組PTV1 mRNA表達水平明顯低于Blank組和siNC組，差異具有統計學意義(F=110.97，P<0.001)。結果說明轉染效果較好(圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測細胞轉染效率注：與si-PTV1相比較，*P<0.05

2.3 沉默PTV1表達對細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果顯示：細胞轉染48 h后，si-PTV1組細胞活性明顯受到抑制，與Blank組和siNC組相比較，差異具有統計學意義(F=9.20，P=0.015，P<0.05)；且細胞轉染72 h后，si-PTV1組細胞活性與Blank組和siNC組差異更明顯(F=30.92，P=0.001)。結果說明沉默lncRNA PTV1的表達可抑制細胞增殖(圖3)。

圖3 CCK-8實驗檢測沉默PTV1表達對IHH-4細胞增殖的影響

注：與si-PTV1相比較，*P<0.05

2.4 沉默PTV1表達對細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示:si-PTV1組細胞凋亡率明顯增加，與Blank組和siNC組相比較，差異具有統計學意義(F=50.87，P<0.05)。結果提示沉默lncRNA PTV1的表達可促進細胞凋亡(圖4)。

圖4 流式細胞術檢測沉默PTV1表達對IHH-4細胞凋亡的影響
注：A：流式細胞圖；B：細胞凋亡率，與si-PTV1相比較，*P<0.05

2.5 沉默PTV1表達對細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示：si-PTV1組穿膜細胞數明顯減少，與Blank組和siNC組相比較，差異具有統計學意義(F=21.73，P=0.002)。該結果說明沉默lncRNA PTV1的表達可抑制細胞的侵襲能力(圖5)。

2.6 沉默PTV1表達對Wnt/β-catenin信號通路的影響

與Blank組和siNC組相比較，si-PTV1組Wnt信號通路蛋白β-catenin(F=14.62，P=0.005)、cyclin D1(F=38.39，P<0.001)及c-myc(F=40.61，P<0.001)的相對表達量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。此結果說明沉默lncRNA PTV1的表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路(圖6)。

圖5 Transwell遷移實驗檢測沉默PTV1表達對IHH-4細胞侵襲能力的影響

注：A：Blank組顯微鏡下穿膜細胞；B:siNC組顯微鏡下穿膜細胞；C：si-PTV1組顯微鏡下穿膜細胞；D：穿膜細胞數，與si-PTV1比較，*P<0.05

圖6 Western blot檢測抑制PTV1表達對β-catenin、cyclin D1及C-Myc蛋白表達水平的影響注：A：Western blot檢測β-catenin、cyclinD1及c-myc蛋白表達；B：蛋白相對表達水平，與si-PTV1相比較，*P<0.05

3 討論

長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸、但無蛋白編碼功能的RNA，其在表觀遺傳學修飾、轉錄調控、細胞增殖和凋亡等多種生物過程中發(fā)揮重要作用[10]。人LncRNA PTV1是小鼠漿細胞瘤位變異位點基因1(plasma-cytoma variant translocaion gene 1)的同源基因，位于染色體8q24區(qū)，長670bp[11]。近年的研究[12]表明，PTV1在多種腫瘤組織或細胞系中高表達，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，抑制凋亡，發(fā)揮類似癌基因的作用。Li等[13]研究證實，LncRNAs在甲狀腺腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。Zhou等[14]研究表明，PTV1在84個甲狀腺癌組織和細胞株中呈現高表達，抑制PTV1表達可明顯抑制甲狀腺癌細胞株的生長，其機制可能與降低細胞周期蛋白D1的表達有關。本研究發(fā)現：甲狀腺癌細胞株中LncRNA PTV1的表達水平明顯高于人正常甲狀腺細胞株HT-ori3，與上述文獻[14]報道的一致，提示PTV1可能是甲狀腺癌的一個潛在獨立的診斷標志；沉默PTV1的表達能夠減弱甲狀腺癌細胞株IHH-4的增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡，提示PTV1可能參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

Wnt信號通路于1982年被發(fā)現，其是一個復雜的蛋白質作用網絡，參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲等多種生物過程，并且在胚胎發(fā)育過程及動物肢體形成過程中發(fā)揮重要作用[15]。研究[16-17]表明Wnt信號通路相關分子在多種腫瘤細胞中異常表達。鄒慧娟等[18]研究發(fā)現：激活后的Wnt信號通路可通過β-catenin上調細胞增殖相關因子c-myc和cyclin D1的水平促進結腸癌細胞的增殖，提示Wnt信號通路參與腫瘤細胞的發(fā)生。新近研究[19]表明PTV1可通過Wnt信號通路調控卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。研究[20]發(fā)現抑制Wnt/β-catenin信號通路可降低甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。本研究發(fā)現：沉默PTV1的表達能夠降低PTC細胞株中Wnt信號通路相關蛋白β-catenin、c-myc和cyclin D1的表達水平，提示PTV1可通過調控Wnt信號通路參與甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲及凋亡過程。

綜上所述，本研究證實了LncRNA PTV1在甲狀腺癌細胞中高表達，沉默PTV1表達能夠抑制PTC細胞增殖和侵襲、促進凋亡，其作用機制可能與降低Wnt信號通路相關蛋白的表達水平有關。本研究結果提示LncRNA PTV1可作為PTC治療的潛在靶點，但其發(fā)揮作用的具體機制還需深入研究。