喉鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs差異表達(dá)譜分析

許咪咪 盧仲明 張思毅 詹建東 盛曉麗 鄧敏鑫

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510280）；2廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510080）

目前，頭頸癌已經(jīng)是全世界第六大高發(fā)癌癥，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有645 000例新發(fā)生的頭頸癌病例[1]，其中超過90%頭頸癌為鱗狀細(xì)胞癌。喉癌作為第二位常見頭頸癌，大多是鱗狀細(xì)胞癌。頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響頭頸癌包括喉癌患者預(yù)后最重要的因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者生存率降低50%[2-3]。因此，術(shù)前頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評(píng)估尤為重要。

miRNA是一類細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的、由22個(gè)單核苷酸組成的、單鏈小分子非編碼RNA，其主要功能為通過降解靶基因mRNA，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[4]。miRNA在某些疾病中的異常表達(dá)，因此miRNA可以作為部分疾病早期診斷的潛在標(biāo)記物。同時(shí)，miRNA及其靶基因也可以作為特定疾病治療的療效評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)指標(biāo)及潛在藥物靶點(diǎn)。越來越多的研究表明，miRNA與喉癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-12]，但絕大多數(shù)研究都集中在miRNA的表達(dá)失調(diào)與喉癌發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)，至今未見與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA表達(dá)譜相關(guān)的報(bào)道。

本研究運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)，通過檢測(cè)分析喉鱗狀細(xì)胞癌（又稱喉鱗癌、喉癌）組織中miRNA的表達(dá)特點(diǎn)，尋找有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌腫瘤組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者差異表達(dá)的miRNA，探討其與喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為后續(xù)尋找與喉癌早期診斷及轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在的分子標(biāo)志物打下初步基礎(chǔ)，為提高喉癌生存率及保喉率，最終改善喉癌的治療效果，提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源miRNA芯片入組患者：選擇5例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性喉鱗癌組織，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織，為無轉(zhuǎn)移組，將兩組患者的腫瘤組織進(jìn)行miRNA基因芯片分析并篩選。入組患者的臨床資料見表1。

qRT-PCR入組患者：選擇40例原發(fā)性喉鱗癌組織，20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（表2）。

1.2 標(biāo)本的收集、保存采用標(biāo)本庫里凍存的喉鱗癌腫瘤組織，所有標(biāo)本均來自廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2007年10月至2018年7月手術(shù)切除的喉癌組織，術(shù)中均取病理組織證實(shí)喉癌。本次實(shí)驗(yàn)入組所有患者均為就診于廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科并進(jìn)行手術(shù)者，術(shù)前或者術(shù)中取病理確診喉鱗狀細(xì)胞癌，所有病例均為初治患者，術(shù)前未接受過放、化療及其他腫瘤的特殊治療。所有病例均進(jìn)行詳細(xì)的臨床病理資料分析及隨訪。在參加本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)之前所有參與患者均簽署了書面知情同意術(shù)。本次實(shí)驗(yàn)樣本的收集及使用通過了廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 喉癌組織miRNA表達(dá)譜分析本實(shí)驗(yàn)采用第六代miRCURYTMLNA寡核苷酸芯片（丹麥Exiqon公司），超過1 891個(gè)探針。

1.4 總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)應(yīng)用Trizol（Invitrogen公司）和miRNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司）抽提總RNA，使用分光光度計(jì)ND-1000（Nanodrop公司）測(cè)定RNA的質(zhì)量和定量，凝膠電泳判定RNA的完整性。

1.5 miRNA的標(biāo)記與芯片雜交采用miRCURYTM Array Power標(biāo)記試劑盒，按照試劑盒說明操作，進(jìn)行miRNA的標(biāo)記。熒光標(biāo)記后的樣品，按說明書進(jìn)行芯片雜交。

1.6 芯片掃描及數(shù)據(jù)處理采用Axon Gene Pix 4000B進(jìn)行掃描，掃描得到的圖像用Gene Pix pro V6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和坐標(biāo)調(diào)整，數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用芯片顯著性分析軟件（significance analysis of microarrays，SAM）進(jìn)行完成，設(shè)定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）為 0.05；再采用 MEV software（v4.6，TIGR）對(duì)篩選出的miRNA進(jìn)行聚類分析。根據(jù)表達(dá)水平定義高表達(dá)和低表達(dá)的miRNAs，篩選出在喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)差異的miRNAs。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證另取40對(duì)喉癌組織標(biāo)本（20例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），提取總RNA。以U6為內(nèi)參照，采用SYBR Green染料法，對(duì)芯片分析結(jié)果中的5個(gè)miRNA：miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在各樣品中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法MicroRNA基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SAM軟件進(jìn)行分析，設(shè)定FDR為0.05，篩選出有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組之間差異表達(dá)的miRNA。用SPSS 19.0軟件分析，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本RNA純度及質(zhì)量檢測(cè)使用分光光度計(jì)ND-1000測(cè)定各標(biāo)本RNA的OD值，OD260/OD280比值為1.9～2.1。凝膠電泳條帶分析未見明顯RNA降解及DNA污染等（圖1）。結(jié)果表明樣品總RNA未降解、質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 用于芯片實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本RNA凝膠電泳圖像Fig.1 Gel electrophoresis image of the samples RNA

2.2 miRNA芯片掃描結(jié)果筆者通過miRNA芯片篩查得到了2 662個(gè)差異表達(dá)的miRNA，將其中無法檢測(cè)到的miRNA及非人類miRNA剔除后，得到780個(gè)miRNA。采用SAM軟件分析，設(shè)定FDR為0.05，發(fā)現(xiàn)相對(duì)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中共有387個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)，22個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào)。見圖2、3。

圖2 喉鱗狀細(xì)胞癌miRNA微陣列芯片熱點(diǎn)圖Fig.2 Heatmap ofmiRNA microarray in laryngeal squamous cell carcinoma

圖3 通過SAM軟件分析獲得的顯著差異的miRNA基因Fig.3 Siginificant miRNA genes identified using SAM software

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果對(duì)miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203等 5個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在40例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組喉鱗狀細(xì)胞癌組織之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將基因芯片分析結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行比較，結(jié)果顯示這5個(gè)miRNA表達(dá)均下調(diào)，miRNA基因芯片分析結(jié)果與qRT-PCR的相符，見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)移組及無轉(zhuǎn)移組miRNA的qRT-PCRFig.4 qRT-PCR of the lymphatic metastasis group and the control group

3 討論

影響喉癌的預(yù)后因素很多，其中頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為一重要因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌預(yù)后較差，因此對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，學(xué)者們均持積極態(tài)度，主張行治療性頸清掃術(shù)[13]。以往雖然有大量關(guān)于喉癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究，但仍未發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)指標(biāo)能夠特異性的早期預(yù)測(cè)喉癌的轉(zhuǎn)移。所以，找出一種可以早期預(yù)測(cè)喉癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，有助于個(gè)體化選擇治療方案。

miRNA是一類細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的、由22個(gè)單核苷酸組成的、單鏈小分子非編碼RNA，其主要功能為通過降解靶基因mRNA，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[4]。有研究顯示，超過半數(shù)的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因組區(qū)[14]。miRNAs還可作用于細(xì)胞周期以及影響細(xì)胞的凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程[15-16]。自從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA以來，其與腫瘤就存在著密切關(guān)聯(lián)，目前miRNA已在腫瘤的發(fā)生、診斷和治療等領(lǐng)域中取得一系列的研究進(jìn)展。但是，就目前喉癌的相關(guān)研究而言，尚未發(fā)現(xiàn)兼具早期敏感性和組織特異性的miRNA。

本課題組前期通過miRNA芯片技術(shù)探測(cè)到了喉癌組織中的miRNAs表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，在喉癌組織中11種miRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，表達(dá)顯著下調(diào)的miRNAs有114個(gè)，并且發(fā)現(xiàn)了 miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-203、let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-195-5p等6個(gè)miRNA在基因芯片分析及qRT-PCR中表達(dá)均顯著下調(diào)[8，17-18]。王蕊等[9]對(duì)4對(duì)喉癌腫瘤組織及癌旁組織行miRNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，22種miRNAs在喉癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，20種表達(dá)顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-3195表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。魏明輝等[12]發(fā)現(xiàn)喉鱗癌腫瘤組織和癌旁組織中有53個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中31個(gè)下調(diào)，22個(gè)上調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌[19-20]、食道癌[21]中miRNA異常表達(dá)，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。近年來越來越多對(duì)喉癌及癌旁組織miRNAs差異表達(dá)譜的分析，但是喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs差異表達(dá)譜尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，選取10例喉鱗狀細(xì)胞癌新鮮凍存的腫瘤組織（5例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），采用miRNAs表達(dá)譜芯片通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)了22個(gè)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA和387個(gè)表達(dá)下調(diào)。本研究通過SAM軟件初篩，根據(jù)檢測(cè)樣本≥3，q-value≤5%，差異倍數(shù)＞2為顯著上調(diào)，差異倍數(shù)＜0.5為顯著下調(diào)，在差異表達(dá)的miRNAs中發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍以上的僅有5個(gè)，且表達(dá)均下調(diào)，分別miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203。其中miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-203在本團(tuán)隊(duì)的前期的研究工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織及癌旁組織中差異表達(dá)并驗(yàn)證。本研究對(duì)5個(gè)miRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，這樣可以延續(xù)筆者過往的研究，以期對(duì)將來的研究奠定基礎(chǔ)。

通過qRT-PCR驗(yàn)證，miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)均顯著下調(diào)，這與基因芯片分析結(jié)果一致，說明本研究的基因芯片分析結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。證明了有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比存在差異表達(dá)的miRNAs，結(jié)果提示這些差異表達(dá)的miRNAs可能在喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

miR-144-3p已在本團(tuán)隊(duì)的前期研究工作中被證實(shí)可以通過靶向ETS-1調(diào)控喉癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[22]，并初步發(fā)現(xiàn)其可以抑制喉癌細(xì)胞的增殖[23]。這提示有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中差異表達(dá)的miRNAs可能與喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。這為筆者后續(xù)研究miR-125a對(duì)喉癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用提供初步的依據(jù)。

然而，基因芯片分析及qRT-PCR驗(yàn)證的miRNAs是否真正參與喉癌的發(fā)省發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移，需要將來在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及大規(guī)模的臨床標(biāo)本中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。