分泌型卷曲相關蛋白1和β-聯蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

肖遠俊，朱顓頊，蹇露，羅森源，田磊#

十堰市太和醫院1耳鼻咽喉頭頸外科，2婦產科，3病理科，湖北 十堰 442000

喉癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率較高，喉鱗狀細胞癌是喉癌最常見的病理類型，約占全部喉癌類型的90%[1-2]。目前研究認為，遺傳、環境等多種因素均與喉鱗狀細胞癌有關。某些類型的喉癌，如聲門下喉癌、跨聲門喉癌發病位置隱蔽，早期不易診斷，而聲門型喉癌雖然早期癥狀為發音易疲倦、無力等聲音改變，但并無其他臨床癥狀，多易被誤診為“咽喉炎”。多數患者確診喉癌時，已處于中晚期而不易治療[3]。WNT/β-聯蛋白（βcatenin）信號通路與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關。β-catenin是WNT信號通路的調控因子之一，參與調控WNT/β-catenin信號通路。分泌型卷曲相關蛋白 1（secreted frizzled related protein 1，SFRP1）是近年來新發現的WNT信號通路的阻斷劑，對WNT信號通路的信號傳導有重要影響[4]。目前，國內關于SFRP1和β-catenin在喉鱗狀細胞癌中的研究較少。因此，本研究旨在探討喉鱗狀細胞癌的發病機制和轉移機制，采用免疫組織化學染色法檢測SFRP1和β-catenin蛋白的表達情況，探討其在喉鱗狀細胞癌發生發展過程中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年1月十堰市太和醫院收治的喉鱗狀細胞癌患者。納入標準：患者除原發性腫瘤外，無其他部位惡性腫瘤；術前未接受過放療、生物治療、化療等其他治療。排除標準：合并高血壓、心血管、肝炎及結核等疾病的患者。依據納入和排除標準，本研究共納入78例喉鱗狀細胞癌患者，其中男63例，女15例；＞55歲55例，≤55歲23例；腫瘤直徑：≤5 cm 46例，＞5 cm 32例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期45例，Ⅲ/Ⅳ期33例；分化程度：中高分化52例，低分化26例；淋巴結轉移：有36例，無42例。78例患者均取得喉鱗狀細胞癌組織標本，其中32例患者于距喉鱗狀細胞癌組織邊緣＞0.5 cm處取得癌旁組織標本。

1.2 主要試劑

兔抗人SFRP1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體檢測試劑盒及二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

取78例患者的喉鱗狀細胞癌組織和其中32例患者的癌旁組織石蠟標本以4 μm的厚度連續切片，常規脫蠟水化。滴加3%的H2O2室溫下孵育10 min，使內源性過氧化酶滅活。熱抗原修復后，室溫下自然冷卻，加入一抗（兔抗人SFRP1、鼠抗人β-catenin抗體，稀釋濃度為1∶100），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次2 min。然后采用DAB顯色劑進行顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在光鏡下觀察SFRP1、β-catenin蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性表達的石蠟切片作為陽性對照[5-6]。

1.4 結果判定

3名及以上病理科醫師采用雙盲法進行觀察。光鏡下隨機選取5個高倍視野（400倍），每個視野計數100個細胞，依據陽性細胞所占百分比進行評分：＜20%為0分，21%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；根據染色強度進行評分：基本無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。SFRP1蛋白主要定位于細胞膜和細胞質，細胞膜和細胞質呈棕黃色顆粒判定為細胞陽性，將陽性細胞所占比例評分和染色強度評分相加，＞3分判定為SFRP1蛋白表達為陽性，≤3分判定為SFRP1蛋白表達為陰性。β-catenin蛋白主要定位于細胞膜，細胞膜呈完整的棕黃色顆粒判定為細胞陽性，將陽性細胞所占比例評分和染色強度評分相加，＞3分且細胞膜著色完整判定為βcatenin蛋白正常表達，≤3分、細胞膜表達減弱或缺失（細胞膜的陽性細胞表達率≤70%）、細胞質或細胞核異位表達（細胞質和細胞核出現顆粒狀染色細胞表達率＞10%）及細胞膜和細胞質混合性染色均判定為β-catenin蛋白異常表達[7]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，喉鱗狀細胞癌患者SFRP1和β-catenin蛋白表達情況的影響因素采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFRP1和β-catenin蛋白表達情況的比較

喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達率為26.92%（21/78），明顯低于癌旁組織的90.63%（29/32），差異有統計學意義（χ2=37.138，P＜0.01）。喉鱗狀細胞癌組織中β-catenin蛋白的異常表達率為85.90%（67/78），明顯高于癌旁組織的21.88%（7/32），差異有統計學意義（χ2=42.244，P＜0.01）。

2.2 78例喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1和β-catenin 蛋白表達情況影響因素的單因素分析

不同年齡、性別和腫瘤直徑喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同TNM分期、分化程度和淋巴結轉移情況喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=8.839、5.379、9.003，P＜0.05）；不同TNM分期、分化程度和淋巴結轉移情況喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中β-catenin蛋白異常表達情況比較，差異均有統計學意義（χ2=10.320、7.706、9.642，P＜0.05）。（表 1）

表1 不同臨床特征喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白的表達情況（n=78）

2.3 78例喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1和β-catenin 蛋白表達情況影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統計學意義的因素（TNM分期、分化程度和淋巴結轉移情況）作為自變量，SFRP1和β-catenin蛋白表達情況作為因變量，納入多元Logistic回歸分析，結果顯示，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化是喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達的獨立保護因素，是β-catenin蛋白異常表達的獨立危險因素；有淋巴結轉移是喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達的獨立危險因素，是β-catenin蛋白異常表達的獨立保護因素。（表2、表3）

表2 78例喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達影響因素的多元Logistic回歸分析

表3 78例喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中β-catenin蛋白異常表達影響因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

WNT信號通路是一條對調控機體早期生長發育、器官形成及其他生理過程有重要作用，且在物種進化過程中高度保守的信號轉導途徑[8]。WNT/β-catenin信號通路是經典的WNT信號轉導途徑，當無WNT信號刺激時，WNT/β-catenin信號通路處于“關閉”的狀態，β-catenin主要與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結合，維持細胞上皮的完整性；但當WNT信號通路被異常刺激后，β-catenin通過核異位啟動轉錄過程，促進腫瘤細胞的異常增殖。β-catenin是細胞中的一種可溶性蛋白，是WNT信號通路的核心因子，β-catenin由細胞質轉移至細胞核的過程，被認為是WNT/β-catenin信號通路激活并發揮作用的重要標志[9]。SFRP1是WNT/β-catenin信號通路的拮抗因子，可以通過競爭性抑制Frizzled（Fz）家族受體從而抑制WNT信號通路的活性。研究表明，SFRP1是喉鱗狀細胞癌中的抑癌基因，可通過啟動子的甲基化而失活[10]。目前，關于喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白表達情況的報道較少，具體作用機制尚不清楚，還需要進一步的研究。

本研究采用免疫組織化學染色法檢測78例喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白的表達情況及其與臨床特征的關系，結果顯示，喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達率為26.92%，明顯低于癌旁組織的90.63%，差異有統計學意義（P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、分化程度為低分化和有淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達率，均低于TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結轉移的患者，表明隨著喉鱗狀細胞癌病情的惡化，SFRP1表達下調或缺失，這可能是因為SFRP1發生甲基化所致。多元Logistic回歸分析結果顯示，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化是喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達的獨立保護因素，有淋巴結轉移是其獨立危險因素，表明SFRP1蛋白有可能成為喉鱗狀細胞癌生長、浸潤和轉移的生物標志物。

此外，本研究結果顯示，喉鱗狀細胞癌組織中β-catenin蛋白的異常表達率為85.90%，明顯高于癌旁組織的21.88%，差異有統計學意義（P＜0.01）；TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化和無淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌患者喉鱗狀細胞癌組織中β-catenin異常表達率，均低于TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、分化程度為低分化和有淋巴結轉移的患者，表明TNM分期越高，β-catenin異常表達率越高，下調β-catenin的表達可能會抑制腫瘤細胞的增殖能力和侵襲能力，但仍需進一步的研究進行驗證，從而為喉鱗狀細胞癌患者尋找新的治療策略。

綜上所述，喉鱗狀細胞癌患者中SFRP1蛋白陽性表達率較低，但β-catenin蛋白的異常表達率較高，且隨著病情的惡化，SFRP1表達下調而β-catenin蛋白的異常表達上調，因此，SFRP1和β-catenin蛋白在喉鱗狀細胞癌患者病情診斷中具有重要的參考價值，可能成為臨床上對喉鱗狀細胞癌患者預后預測 的重要指標及生物靶向治療的新靶點。