宮頸癌組織中FOXP3+Treg與PD-L1的表達情況及與臨床特征的關系分析

彭敏，張玲，羅瓊

廣元市中心醫院婦產科，四川 廣元 628000

宮頸癌為女性生殖系統常見惡性腫瘤，其病死率較高，嚴重威脅中國女性健康[1]。既往研究發現，腫瘤抗原的大量釋放會刺激機體抗腫瘤免疫反應，其中輔助性T細胞（helper T cell，Th）、細胞毒性T細胞在免疫反應中發揮重要作用，叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）為叉頭樣轉錄因子家族成員之一，主要表達于CD4＋CD5＋調節性T細胞（regulatory T cell，Treg），可抑制Th、細胞毒性T細胞及殺傷細胞作用，抑制腫瘤免疫反應，促進腫瘤進展[2]。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）是重要的免疫抑制性分子，Merelli等[3]的研究發現，PD-L1在人類黑色素瘤中有表達，且PD-L1在腫瘤組織中表達是腫瘤預后不良的影響因素，但目前關于PD-L1與宮頸癌的關系研究甚少。本研究主要分析宮頸癌組織中FOXP3+Treg與PD-L1的表達情況及與宮頸癌患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2018年5月于廣元市中心醫院行手術切除的75例宮頸癌患者、38例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者及30例同期因子宮肌瘤行全子宮切除術且術后病理證實無宮頸病變的患者。所有患者均經病理檢查并經復檢確診，術前均未接受放化療、生物治療。宮頸癌患者中，年齡32～62歲，平均（47.18±4.93）歲；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ期 23例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期14例；組織分化程度：低分化25例，中分化32例，高分化18例。CIN患者中，年齡30～63歲，平均（47.15±4.96）歲；CIN分級：Ⅰ級8例，Ⅱ級14例，Ⅲ級16例。子宮肌瘤患者中，年齡31～64歲，平均（47.13±4.97）歲。3組患者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。分別取宮頸癌患者、CIN患者、子宮肌瘤患者相應的宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織。本研究獲得醫院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器與試劑生物組織烤片機購自上海醫療儀器廠，BX50型光學顯微鏡、CK40型倒置顯微鏡均購自日本Olympus公司，標準無酶移液槍頭購自生工生物工程股份有限公司；小鼠抗人FOXP3單克隆濃縮抗體及兔抗人CD3單克隆濃縮抗體均購自英國Abcam公司，小鼠抗人PD-L1多克隆抗體購自美國R&D公司，兔/鼠通用型Streptavidin-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）試劑盒[含二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液]及檸檬酸緩沖液均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學SP法檢測FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達水平①將組織切片置入濕盒，以加樣器滴加適量內源性過氧化物酶封閉液50 μl，室溫孵育30 min后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸洗3次，每次3 min，甩去多余液體；②將組織切片再次置入濕盒，以加樣器滴加適量封閉用正常羊血清工作液50 μl，室溫孵育30 min，甩去多余血清；③擦拭封閉用正常羊血清工作液，以加樣器分別在三份組織中滴加1滴（約50 μl）FOXP3+Treg 抗體工作液、PD-L1 抗體工作液、CD3抗體工作液（須覆蓋整個組織），置入4℃冰箱過夜，采用PBS代替一抗作為陰性對照；④從4℃冰箱取出組織切片后室溫復溫1 h，以PBS浸洗3次，每次3 min，甩去多余液體，加樣器滴加適量生物素標記的羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育，PBS浸洗，甩干，將組織切片再次置入濕盒，加入適量HRP標記的鏈霉親和素，室溫孵育，PBS浸洗，甩干；⑤配置DAB顯色液，滴加適量DAB工作液，光學顯微鏡下觀察并控制顯色時間，自來水沖洗10 min終止顯色，蘇木素復染3～5 min后，以1%鹽酸酒精分化，將染色后的玻片置入75%、85%、95%無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各浸泡5 min；⑥將玻片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10 min使組織透明，在玻片組織上小心滴加中性樹膠1～2滴，加蓋玻片，自然晾干，于顯微鏡下仔細觀察染色結果，記錄并拍照。

1.2.3 陽性判讀計數在細胞膜上和（或）細胞質內有陽性染色的細胞個數，分析FOXP3+Treg、PD-L1蛋白的表達情況。每張切片均選擇細胞數量較多的5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，根據染色強度和陽性細胞所占百分比評分。染色強度：無著色為0分，淡黃色或淡黑色為1分，棕黃色或棕黑色為2分，棕褐色或黑色為3分；陽性細胞所占百分比：0～24%為0分，25%～49%為1分，≥50%為2分。染色強度與陽性細胞所占百分比評分的乘積為0～1分定義為陰性，2～6分定義為陽性。

1.3 資料收集

收集患者資料，包括年齡、病灶大小、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染情況、FIGO分期、組織分化程度、淋巴結轉移情況，分析FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況與臨床特征的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；各變量間的相關性采用Spearman相關性分析，影響因素分析采用Cox回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況的比較

正常組織中較少表達或不表達FOXP3+Treg、PD-L1蛋白。FOXP3+Treg主要表達于腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），在宮頸癌細胞中無表達；PD-L1主要表達于宮頸癌細胞及TIL中，陽性細胞孤立分布或聚集成小片狀，染色強。CD3為T淋巴細胞表面標志物，CD3陽性顆粒定位于TIL，TIL呈小圓形，核大質少，呈點樣分布（圖1）。宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率均高于CIN組織、正常宮頸組織，CIN組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率均高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況（SP染色，×400）

表1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況的比較[n（%）]

2.2 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況與臨床特征的關系

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白陽性表達率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=4.737、5.469、4.172，P＜0.05）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者宮頸癌組織中PD-L1蛋白陽性表達率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（χ2=7.854、5.263、5.567，P＜0.05）；而不同年齡、病灶大小及有無HPV感染的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達情況（n=75）

2.3 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達情況的相關性分析

Spearman相關性分析發現，宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白表達情況與PD-L1蛋白表達情況呈正相關（r=0.602，P＜0.05）。

2.4 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達的影響因素分析

將表2中有統計學意義的因素納入Cox回歸分析模型，結果顯示，FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移為宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達的獨立影響因素。（表3）

表3 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達的影響因素分析

3 討論

近年來宮頸癌發病率呈上升及年輕化趨勢，因此研究宮頸癌發生發展與腫瘤免疫逃逸機制有重要的臨床價值[4]。Treg為一類免疫調節T細胞，其中FOXP3+Treg細胞具有廣泛的免疫抑制性，可通過表面膜分子與其他細胞直接接觸或以分泌抑制性細胞因子等方式抑制體內多種免疫細胞活化及增殖[5-6]。PD-L1屬于CD28/細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）受體亞家族，是免疫反應中極其重要的協同刺激分子，在引起腫瘤微環境免疫耐受中發揮主導作用。有研究顯示，在宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-L1表達有升高趨勢[7]。但目前關于FOXP3+Treg、PD-L1表達與臨床特征的關系研究較少。

本研究結果顯示，FOXP3+Treg主要表達于TIL，PD-L1主要表達于宮頸癌細胞及TIL，且宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率均高于CIN組織、正常宮頸組織，CIN組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率均高于正常宮頸組織，差異均有統計學意義，這與高雁榮和郭玉[8]的研究結果相近，表明在宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達有升高趨勢。Treg可抑制其他T細胞活化，從而阻礙機體免疫系統對腫瘤的監視，并防止腫瘤相關抗原-抗體有效的免疫反應，為腫瘤細胞的免疫逃逸創造有利環境，促進腫瘤發展[9]，而其中FOXP3為Treg細胞最特異的標志，參與Treg細胞的激活及功能調節，是調節免疫動態平衡不可缺少的因子，FOXP3在維持宿主免疫系統對自身抗體的免疫無應答性、抑制過度的免疫反應對宿主造成的損害中有不可或缺的作用[10]。而PD-L1為協同刺激分子，可抑制T淋巴細胞功能，促進Treg功能，PD-L1與程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）結合后使PD-1細胞質區免疫受體酪氨酸活化基序結構域中的酪氨酸磷酸化，募集酪氨酸蛋白磷酸酶-2，使下游酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3-激酶磷酸化，繼而抑制信號轉導，防止自身免疫應答，而隨著宮頸病變級別升高，尤其是宮頸癌患者中細胞免疫抑制效應更強，因此FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率更高。

本研究也發現，FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者宮頸癌組織中的FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率均高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義；而不同年齡、病灶大小及有無HPV感染的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義，這與韓麗萍等[11]、孫曉慧[12]的研究結果基本一致。同時本研究進一步進行Cox回歸分析發現，FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移是宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽性表達的獨立影響因素，因此FOXP3+Treg、PD-L1參與了宮頸癌的發生發展、浸潤及轉移，臨床分期越晚、惡性分化或存在淋巴結轉移患者的FOXP3+Treg、PD-L1表達上調更明顯[13]。本研究也發現，宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白表達情況與PD-L1蛋白表達情況呈正相關（r=0.602，P＜0.05），這與馬茜等[14]通過研究得出的FOXP3+Treg表達與異常分化細胞中的PD-L1表達呈顯著正相關的結果相近。FOXP3為叉頭框蛋白家族成員，其在正常細胞中高度保守，整體蛋白由431個氨基酸構成，而FOXP3是CD4+CD25+FOXP3+Treg發生、發展及發揮功能的關鍵分子，也是目前天然Treg最可靠的表面標志物[15]。FOXP3+在腫瘤局部免疫微環境中發揮著重要作用，PD-L1則表達在活化的T細胞及B細胞上，FOXP3+Treg與PD-L1共同作用，使機體腫瘤環境處于免疫抑制強于免疫應答狀態，促進宮頸病變的發生發展[16]。

綜上所述，免疫調節細胞FOXP3+Treg及相關免疫蛋白PD-L1在宮頸癌組織中高表達，可將其作為探索宮頸癌免疫治療的新靶點。