視網(wǎng)膜動脈與腦動脈粥樣硬化相關(guān)性的實驗研究

楊蕤郡 王海麗 李瑞萍 張俊士 鄧錦波△

1)河南省人口和計劃生育科學技術(shù)研究院，河南 鄭州 450002 2)河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000

腦動脈粥樣硬化癥是中老年人的一種常見病、多發(fā)病，是造成腦卒中的直接病因之一，致殘、致死率極高，對老年人的身體健康造成極大危害[1-3]。最新調(diào)查顯示[4]，腦血管疾病已成為威脅人類生命的重要疾病，同時也是除惡性腫瘤外威脅國民生命安全最危險的“殺手”，位居城鎮(zhèn)居民死亡原因的第1位。目前，多通過顱內(nèi)磁共振血管成像、血管造影等大型檢查，結(jié)合彩色多普勒超聲以及實驗室檢查等手段對腦動脈粥樣硬化作出診斷，但這些檢查手段有的對人體傷害較大，有的費用高，有的手續(xù)繁瑣[5-12]，給患者帶來諸多不便。因此，找出一種快速、簡便、廉價、高效的診斷方法尤為重要。本研究通過動物實驗結(jié)合臨床資料的分析，對眼底動脈硬化與腦動脈硬化之間的關(guān)系進行研究，以期通過檢查患者眼底動脈狀況評估和診斷腦動脈硬化，從而降低檢查成本，實現(xiàn)快速、高效、無損傷的診斷。目前，國內(nèi)已有團隊對臨床上腦動脈粥樣硬化與視網(wǎng)膜動脈硬化間的關(guān)系進行研究[13-15]，但缺乏臨床資料與基礎(chǔ)研究的支撐。本研究通過對小鼠視網(wǎng)膜動脈的觀察，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)的整理分析，對視網(wǎng)膜動脈硬化與腦動脈硬化之間的相關(guān)性做進一步的探討。

1 材料和方法

1．1實驗動物河南省實驗動物中心提供用于繁殖的雌雄昆明小鼠(合格證號：SCXK豫2010-0002)，將其飼養(yǎng)在室溫22～25 ℃、相對濕度60%～70%的狀況下。定期消毒，房間面積20 m2。按自然晝夜節(jié)律采光、自由進食和飲水。成年健康雌雄鼠于18：00時以2∶1合籠，次日08：00前查栓，以觀察雌鼠陰道栓塞之日計為受孕當日，也稱E0(embryonal day 0，E0)；仔鼠誕生當日計為P0(postnatal day 0，P0)。新生小鼠飼養(yǎng)至成年(P90)新生小鼠飼養(yǎng)至成年(P90)及老年(約P360)，成年小鼠12只，老齡小鼠13只，共25只。

1．2免疫組織化學染色用10%水合氯醛(1～1.5 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后，先用37 ℃生理鹽水經(jīng)左心室灌流，后用4%多聚甲醛經(jīng)左心室進行灌流，取下眼球，剪去與眼球相連的視神經(jīng)，體式顯微鏡下分離出視網(wǎng)膜，制備不同年齡的視網(wǎng)膜鋪片。視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次5 min，放入4% PFA 4 ℃固定2～3 h，然后PBS漂洗3次，每次15 min，用一抗4 ℃孵育過夜，一抗為兔抗鼠Ⅳ型膠原蛋白(血管基底膜標記物，Collagen Ⅳ，1∶600，Abcam，ab6586)。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。二抗為Alex/Fluro568標記羊抗兔IgG(1∶600，Invitrogen，A10042)，4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。洗好后將視網(wǎng)膜剪成“十”字花型，將視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層向上平鋪在干凈的載玻片上，滴加封片劑，加蓋蓋玻片，指甲油封固四周，晾干后在熒光顯微鏡下(BX61，Olympus)觀察拍片。

1．3明膠墨汁灌流顯示小鼠視網(wǎng)膜上的血管網(wǎng)用10%水合氯醛(1～1.5 mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后，先用37 ℃生理鹽水經(jīng)左心室灌流，后用4%多聚甲醛經(jīng)左心室進行灌流，再用約37 ℃生理鹽水灌流至流出的液體變清，再用60 ℃的6.5%明膠墨汁灌流至全身變黑，然后在小鼠心臟根部結(jié)扎，放入—20 ℃冰盒中冷凍2 h左右。取下眼球，剝離視網(wǎng)膜，剪成“十”字花型，平鋪在干凈的載玻片上，用0.01 mol/L PBS封片，指甲油封固四周，晾干后在顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層血管以及血管半徑變化并拍片。

1．4臨床資料收集研究對象選取2017-05—10在河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及老年病學科就診的患者。采取檢查結(jié)果和問卷調(diào)查相結(jié)合的方法，收集對照組和視網(wǎng)膜動脈硬化組患者的眼底鏡、頭部磁共振血管成像檢查及生化資料。所有研究對象由眼科及神經(jīng)內(nèi)科專科醫(yī)生根據(jù)病史、臨床癥狀和輔助檢查結(jié)果進行嚴格篩選和診斷。按診斷結(jié)果分為視網(wǎng)膜動脈硬化組和對照組。腦血管檢查主要包括頭部磁共振血管成像(MRA)、頸部血管彩超、血液生化檢查等。眼科檢查包括視力、眼壓、裂隙燈、眼底鏡檢查(12500-DY型眼底鏡)等。根據(jù)納入標準和排除標準，最終22例進入資料分析統(tǒng)計。納入標準：(1)對本實驗知情的前提下自愿加入者；(2)能積極配合各項檢查，可在小瞳下觀察視網(wǎng)膜血管者。排除其他非動脈粥樣硬化導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變。

1．5數(shù)據(jù)測量與統(tǒng)計學處理

1．5．2 臨床數(shù)據(jù)處理：根據(jù)收集到的數(shù)據(jù)采用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，錄入對照組和動脈硬化組成員各項參數(shù)，如血脂、血糖、C反應(yīng)蛋白等血液生化檢查結(jié)果，頸動脈彩超，尤其是視網(wǎng)膜以及腦動脈硬化檢查結(jié)果的各種數(shù)據(jù)。采取t檢驗、χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1視網(wǎng)膜血管老化觀察由抗體Collagen Ⅳ標記的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)成年小鼠與老齡鼠視網(wǎng)膜血管不同(圖1)。成年小鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)密集，血管之間的吻合支較多，血管分支較多，血管管徑較大(圖1A)。老齡鼠的視網(wǎng)膜血管較稀少，血管之間的吻合支較少，血管分支減少，管徑變細(圖1E)。高倍鏡觀察視網(wǎng)膜動脈，發(fā)現(xiàn)成年小鼠的無細胞毛細血管數(shù)較多(圖1C)，老齡鼠的無細胞毛細血管數(shù)較少(圖1B)。隨著小鼠發(fā)生老化，小鼠血管網(wǎng)密度下降，血管體密度減少(圖2)。墨汁灌流結(jié)果與抗體Collagen Ⅳ標記的小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)發(fā)育情況一致(圖1D、F)。

圖1 成年小鼠和老齡小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)比較 A～D：熒光顯微鏡下小鼠血管比較；A、C：低倍鏡下成年小鼠和老齡小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的大體比較；A：在小鼠剛成年時視網(wǎng)膜血管分支較多，血管網(wǎng)密集，血管較粗；C：隨著小鼠年齡的增長，老齡小鼠的視網(wǎng)膜血管減少，分支也逐漸減少，血管網(wǎng)較為稀疏管徑較細，靠近視乳頭部分血管分支減少；B、D：顯示高倍鏡下小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的局部發(fā)育情況；B：成年小鼠視網(wǎng)膜血管吻合分支較多，且無細胞毛細血管數(shù)(→)分布密集；D：老齡小鼠分支明顯減少，無細胞毛細血管(→)稀疏；E、F：光學顯微鏡下小鼠血管比較；E：成年小鼠血管分支較多，走形平緩；F：老年小鼠分支減少，走形僵硬，彎曲度增加；A～D：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)標記由抗體Collagen Ⅳ標記(紅色)；E、F：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)通過墨汁灌流顯示。A、C：標尺=100 μm；B～F：標尺=50 μmFigure 1 The comparison of retinal vascular networks in adult mice and aged mice A-D：The retinal vascular networks in mice under fluorescence microscope (Collagen Ⅳ fluorescent labeling)；A，C：General comparison of retinal vascular networks in adult mice and aged mice at low magnification；A：The adult mice have larger diameter retinal blood vessel caliber，multiple vascular branches and dense network of vessels；C：The number of retinal vascular，vascular branches and the density of vasculosum are all decreased with the age increase of the adult mice；B，D：The local development of retinal vascular network in mice with high magnification；B：The adult mice have abundant microvascular anastomosis and thick acellular capillaries (→)；D：The reduction of microvascular anastomosis and acellular capillaries(→) is obviously in aged mice；E，F(xiàn)：The retinal vascular networks of mice under light microscope (Gelatin-ink perfusion)；E：The adult mice have numerous branches of vessels which run gently；F：The aged mice have fewer branches of vessels whose courses are stiff and contorted．A，C：Bar=100 μm；B-F：Bar=50 μm

2．2臨床資料

2．2．1 視網(wǎng)膜動脈硬化：眼底鏡下，正常組視網(wǎng)膜血管分布均勻，粗細適中，折光性不強(圖3A)。視網(wǎng)膜動脈硬化患者的視網(wǎng)膜發(fā)生改變，可分為4個級別[16]。Ⅰ級視網(wǎng)膜血管硬化：未見明顯的小動、小靜脈交叉處的壓迫征，但可以發(fā)現(xiàn)眼底小動脈管徑大小不均、管徑變細、動脈反光帶加寬；Ⅱ級視網(wǎng)膜血管硬化：小靜脈兩端變細或出現(xiàn)“S”樣、“Z”樣移位，同時伴隨反光帶增寬且呈銅絲樣外觀；Ⅲ級視網(wǎng)膜血管硬化：動靜脈交叉處典型壓迫癥普遍存在，伴視網(wǎng)膜片狀出血、棉絨斑和水腫，眼底小動脈外觀呈銅絲樣(圖4A)；Ⅳ級視網(wǎng)膜血管硬化：眼底小動脈呈呈銀絲狀，嚴重動靜脈交叉壓迫癥較為廣泛，并出現(xiàn)視乳頭水腫。

2．2．2 腦動脈粥樣硬化觀察：視網(wǎng)膜動脈硬化組患者有以下病變：①頭部磁共振血管成像顯示，顱內(nèi)動脈管壁走形僵硬，管腔變窄，動脈顯影略細，動脈分支走行異常(圖3B、4B)；②頸部血管彩色多普勒超聲檢查顯示，動脈硬化患者的血管內(nèi)膜粗糙，血管壁內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增加，回聲不均勻，且探及到動脈硬化斑塊產(chǎn)生，血管出現(xiàn)狹窄(圖3C、4C)。

2．2．3 腦動脈粥樣硬化與視網(wǎng)膜動脈硬化的關(guān)系：對照組8例中7例未發(fā)生腦動脈粥樣硬化，1例出現(xiàn)腦動脈粥樣硬化表現(xiàn)。視網(wǎng)膜動脈硬化組14例均出現(xiàn)不同程度的腦動脈粥樣硬化。眼底動脈硬化患者均發(fā)生腦動脈硬化(P<0.01)。眼底動脈硬化程度Ⅰ級患者的腦動脈粥樣硬化病變程度較輕，隨著眼底動脈硬化分級的增加，腦動脈粥樣硬化程度也趨于嚴重。

3 討論

3．1血管稀疏是視網(wǎng)膜老化主要特征在小鼠發(fā)育早期，我們可以看到小鼠視網(wǎng)膜血管從視乳頭開始向周圍呈輻射狀生長。出生14 d后，小鼠視網(wǎng)膜血管已遍布視網(wǎng)膜各層，至成年趨于穩(wěn)定[17-19]。隨著小鼠日齡增加，老齡小鼠的視網(wǎng)膜血管叢變得稀疏，血管之間的吻合支較少，血管分支減少，管徑變細，血管體密度下降。有資料表明，在發(fā)育過程中視網(wǎng)膜細胞壁發(fā)生纖維化，同時伴隨血壓升高和血脂異常引起的暫時性或持續(xù)性微血管損害，進而視網(wǎng)膜動脈發(fā)生狹窄、收縮，導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜動脈管徑變細[20-22]。在持續(xù)的高血壓狀態(tài)下，血-視網(wǎng)膜屏障遭到局部破壞，導(dǎo)致血管通透性增加，并伴隨血管內(nèi)皮損傷等因素，小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生退行性變化，小鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)密度下降，血管叢較為稀疏[23-26]。同時，由于小鼠細胞因子分泌的變化等因素，小鼠視網(wǎng)膜吻合支減少，因此，小鼠視網(wǎng)膜整體處于老化狀態(tài)。

3．2眼底動脈硬化與腦動脈粥樣硬化有正相關(guān)關(guān)系腦動脈粥樣硬化癥是老年人較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要特征是顱內(nèi)血管彌漫性硬化、管腔狹窄及小血管閉塞，導(dǎo)致供應(yīng)腦實質(zhì)的血流減少，神經(jīng)細胞發(fā)生變性所引起的一系列神經(jīng)與精神癥狀[27]。臨床早期常出現(xiàn)頭痛、頭暈、耳鳴、失眠、記憶力減退、四肢麻木、情緒不穩(wěn)定等癥狀，隨著病程進展，繼而發(fā)生腦供血不足、腦卒中、血管性癡呆等較為嚴重的疾病[28-32]。有文獻指出，高血壓、高血脂、心功能分級的危險因素和心腦動脈硬化有直接關(guān)系[33-34]，腦動脈粥樣硬化好發(fā)于大腦的基底動脈和大腦中動脈等部位，視網(wǎng)膜血管與大腦的基底動脈和中動脈所處環(huán)境相似，且管壁較薄，周圍保護組織較少，因此，視網(wǎng)膜血管變化可敏感地反映出基底動脈和大腦中動脈硬化狀況[35-40]。

圖2 成年和老齡小鼠的血管密度統(tǒng)計 與成年小鼠相比，老齡小鼠的血管密度明顯下降，P<0.01，**P<0.01Figure 2 The histogram of vascular density in adult and aged mice.Compared with adult mice，the vascular density of aged mice declines dramatically，**P<0.01

圖3 A：對照組患者眼底動脈分布均勻，血管分支走形正常，視盤與黃斑發(fā)育正常；B：顱內(nèi)磁共振血管成像結(jié)果可以看到對照組患者顱內(nèi)動脈走形自然，管壁光滑，分布未見明顯異常；C：頸內(nèi)動脈管徑對稱，內(nèi)-中膜厚度正常，回聲均勻，流速正常Figure 3 A：Result of ophthalmoscopy：the distribution of the fundus arteries was uniform，the evenly distributed fundus artery runs mildly and the optic disc and macular development are normal；B：Intracranial MRA shows the cerebral arterial branch is rich in natural form of uniform distribution and smooth wall；C：The carotid artery ultrasonography examination fund the internal carotid is symmetrical in homogeneous echogenicity of normal IMT and normal flow velocity

視網(wǎng)膜動脈硬化診斷一般采用Keith-Wagener分級[41]方法。早期僅表現(xiàn)為功能性狹窄、動靜脈壓跡和管徑比例的變化、動脈走行與分支的變化；隨著動脈硬化的進一步發(fā)展，視網(wǎng)膜動脈管徑出現(xiàn)明顯的功能性狹窄，同時可能伴隨出血、滲出、視乳頭水腫等病變，影響患者視力，嚴重時可導(dǎo)致患者失明等[42-43]。視網(wǎng)膜中央動脈是腦循環(huán)系統(tǒng)的一部分，均為頸動脈分支，因此，二者血流變化具有同步性。由于年齡增加，視網(wǎng)膜血管壁局部纖維組織增厚變化與腦動脈血管具有一致性，頸動脈血壓升高、血流流速的沖擊等使得視網(wǎng)膜動脈與腦動脈的整體變化相似，且視網(wǎng)膜血管是人體唯一能夠直接觀察到的血管，變化較為靈敏。因此，視網(wǎng)膜動脈管徑、分支及走形的變化對腦動脈變化的預(yù)測都具有臨床意義，可較為方便地對腦血管狀況進行評估。

本研究發(fā)現(xiàn)，眼底動脈硬化與腦動脈粥樣硬化有正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，視網(wǎng)膜動脈硬化患者均伴一定程度的腦動脈粥樣硬化病變，且隨著眼底動脈硬化程度的增加，腦動脈粥樣硬化程度愈加嚴重，即眼底動脈硬化狀況與腦動脈粥樣硬化病變程度存在正相關(guān)關(guān)系。通過本實驗有理由相信，通過定期觀察視網(wǎng)膜動脈硬化程度有利于對全身動脈硬化程度作出評估和對腦卒中等疾病的早期預(yù)防和控制，也可作為臨床預(yù)后的指標，具有較高的理論與臨床應(yīng)用價值。因此，觀察視網(wǎng)膜動脈硬化為腦動脈粥樣硬化癥的早期篩查、預(yù)防提供了更為便捷，高效，無創(chuàng)的診斷方法。

圖4 A：視網(wǎng)膜動脈硬化患者的視網(wǎng)膜眼底血管動靜脈管徑比例下降，血管走形僵硬，出現(xiàn)動靜脈壓跡，小血管呈銅絲樣外觀；B：雙側(cè)頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段管壁走行僵硬，右側(cè)管腔狹窄，左側(cè)血管局部狹窄，遠端分支減少；C：雙側(cè)頸動脈內(nèi)-中膜不均勻增厚(→)，回聲不均勻，雙側(cè)頸動脈均有動脈硬化斑塊形成Figure 4 A：Result of ophthalmoscopy revealed vascular attenuation of eyeground artery which has an abnormal route，"AV nicking" and "Copper Wiring" with irregularly located；B：Intracranial MRA demonstrate that the decrease in the distal vascular branches and the stenosis of intracalvarium of internal carotid artery in the left and the right；C：The carotid artery ultrasonography examination suggest an unequal thickening of IMT(→)，unequal echo and atherosclerosis plaques formation in the left and the right