痛風(fēng)泰顆粒水提工藝的優(yōu)化

王佛長， 黃詩瑩， 陳劍平， 張尚斌， 謝靜靜， 張劍勇*

（1. 深圳市中醫(yī)院， 深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室， 廣東 深圳518033； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 深圳518033）

痛風(fēng)泰是著名嶺南溫病學(xué)家劉仕倡先生獻方,深圳市中醫(yī)院張劍勇醫(yī)生整理并結(jié)合臨床經(jīng)驗調(diào)整而成, 為治療痛風(fēng)的有效方劑, 由山慈菇、 土茯苓、 粉萆薢、 秦艽、 赤芍、 川牛膝、 山茱萸7 味藥材組成, 具有清熱利濕、 解毒化濁、 祛瘀止痛等功效, 臨床應(yīng)用5 年以上, 療效確切安全[1-6], 但其劑型為湯劑, 攜帶不便, 服用量大, 不能很好滿足現(xiàn)代都市人需求, 故本實驗擬將其進一步研制成顆粒劑以方便患者服用。 前期研究表明, 痛風(fēng)泰中臣藥土茯苓有效成分落新婦苷具有鎮(zhèn)痛、 活血化瘀、抑制高尿酸血癥等作用[7]； 佐藥赤芍的指標(biāo)性成分為芍藥苷, 與其他中藥配伍可治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎, 有著抗炎、 抗凝、 抗血栓作用[8], 故本實驗以這2 種成分含有量結(jié)合干膏得率為評價指標(biāo), 正交試驗優(yōu)化痛風(fēng)泰顆粒水提工藝, 為該制劑放大生產(chǎn)提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-2030 高效液相色譜儀、 AUMA220D分析天平（日本島津公司）； 超聲波清洗儀（250 W、 40 kHz, 深圳市和科達超聲設(shè)備有限公司）；500-2 恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）； HHS 電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 落新婦苷（批號111798-201504, 含有量93.9%）、 芍藥苷（批號wkq17102709, 含有量≥98%） 對照品分別購自中國食品藥品檢定研究院、四川省維克奇生物科技有限公司。 山慈菇（批號17100101）、 秦艽（批號17101901）、 赤芍（批號17061001） 均購自深圳市華輝藥業(yè)有限公司, 土茯 苓 （ 批 號 20170801 ）、 粉 萆 薢 （ 批 號170709001）、 川牛膝（批號171101）、 山茱萸（批號180101） 分別購自深圳市合丹醫(yī)藥有限公司、康美藥業(yè)股份有限公司、 廣州至信中藥飲片有限公司、 廣東源森泰藥業(yè)有限公司, 經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室專家鑒定為正品, 均符合2015 年版《中國藥典》 一部要求。 甲醇、 乙腈為色譜純（美國默克公司）； 其余試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 優(yōu)化參數(shù)確定 按處方比例稱取方中山慈菇、土茯苓、 粉萆薢等7 味藥材, 加水煎煮, 濾過, 放冷, 濾液濃縮并定容至500 mL。 采用正交試驗,以濃縮液中落新婦苷、 芍藥苷含有量及干膏得率為評價指標(biāo), 加水量（A）、 煎煮時間（B）、 煎煮次數(shù)（C） 為影響因素, 正交試驗進行優(yōu)化, 因素水平表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 干膏得率測定 精密量取“2.1” 項下濃縮液25 mL, 置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中, 水浴蒸干, 按照干燥失重測定法（2015 年版《中國藥典》 四部通則0831） 測定, 計算干膏得率, 公式

2.3 落新婦苷、 芍藥苷含有量測定

2.3.1 色譜條件 Hypersil ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B）, 梯度洗脫（1～18 min, 17% ～23%A； 18～25 min, 90%A； 25～30 min, 17%A）； 檢測波長230 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量0.8 mL/min；進樣量5 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液 精密稱取落新婦苷、 芍藥苷對照品適量, 甲醇分別制成含兩者0.20、0.50 mg/mL的溶液, 即得。

2.3.2.2 供試品溶液 取“2.1” 項下濃縮液適量, 過0.45 μm 微孔濾膜, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液 按處方量分別稱取不含土茯苓、 赤芍的陰性樣品, 按“2.3.2.2” 項下方法制備, 即得。

2.3.3 專屬性考察 取對照品、 供試品、 陰性樣品溶液, 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 結(jié)果見圖1, 可知供試品溶液在與對照品溶液同一保留時間處有相同色譜峰, 陰性無干擾。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量,甲醇逐級稀釋成分別含落新婦苷0.050 6、 0.101、0.202、 0.405、 0.810、 1.62 mg/mL, 芍藥苷0.054 4、0.109、 0.218、 0.435、 0.870、 1.74 mg/mL。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸, 得方程分別為落新婦苷Y=1.550 45×107X+425 997 （r=0.999 8）、 芍藥苷Y=7.722 81×106X+232 333 （r= 0.999 9）, 分別在0.050 6 ～1.62、 0.054 4～1.74 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 檢測限與定量限 按信噪比S/N=3, 落新婦苷、 芍藥苷檢測限分別為0.36、 0.45 μg/mL；按信噪比 S/N = 10, 兩者定量限分別為1.16、 1.53 μg/mL。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量,在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次, 測得落新婦苷、 芍藥苷峰面積RSD 分別為1.64%、0.43%, 表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量, 于0、2、 4、 6、 12、 24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得落新婦苷、 芍藥苷峰面積RSD 分別為0.30%、 0.55%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗 取同一供試品溶液6 份, 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得落新婦苷、芍藥苷峰面積RSD 分別為1.01%、 0.87%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取落新婦苷（0.922 mg/mL）、 芍藥苷（0.685 mg/mL） 含有量已知的濃縮液適量, 共9 份, 分別精密加入相當(dāng)于各成分含有量50%、 100%、 150% 的對照品, 按“2.3.2.2” 項 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液, 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 計算回收率。結(jié)果, 落新婦苷、 芍藥苷平均加樣回收率分別為96.15%、 95.32%, RSD 分別為0.68%、 1.43%。

2.4 綜合權(quán)重系數(shù)計算 層次分析（AHP） 法是主觀權(quán)重賦值, 而客觀權(quán)重賦權(quán)（CRITIC） 法是客觀權(quán)重賦值, 本實驗采用AHP-CRITIC 混合加權(quán)法[9]。 根據(jù)中藥復(fù)方君臣佐使規(guī)律及各成分藥理作用強弱, 將落新婦苷、 芍藥苷含有量及干膏得率作為權(quán)重指標(biāo)予以量化, 即每個指標(biāo)分成3 個層次, 并確定優(yōu)先順序為落新婦苷含有量＞芍藥苷含有量＞干膏得率, 構(gòu)建指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣[10], 結(jié)果見表2。然后, 通過AHP 分析軟件進行具體計算, 測得落新婦苷含有量、 芍藥苷含有量、 干膏得率權(quán)重系數(shù)分別為0.558 4、 0.319 6、 0.122 0。 一致性比例因子（CR） = CI/RI, 當(dāng)CR＜0.1 時, 指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣具有理想的一致性, 權(quán)重系數(shù)有效,本實驗中CR 為0.017 6, 表明權(quán)重計算正確。 再將表2 數(shù)據(jù)經(jīng)線性插值處理[指標(biāo)成分值= （實測值-最小值） / （最大值-最小值） ×100], 消除單位量綱后計算各指標(biāo)對比強度 （si）、 沖突性（δi）、 綜合權(quán)重 （ci）、 權(quán)重 （ωi）[11-12], 結(jié)果見表3。

表2 指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣Tab.2 Judgement priority matrices for the pair comparison of indices

綜合AHP 法和CRITIC 法, 根據(jù)公式ω （綜）ij=ω （ AHP ）ij× ω （ CRITIC）ij/∑ω （ AHP ）ij×ω （CRITIC）ij, 得到落新婦苷含有量、 芍藥苷含有量、 干膏得率綜合權(quán)重分別為0.503 5、 0.400 9、0.095 6。

表3 相關(guān)計算數(shù)據(jù)Tab.3 Relevant calculation data

2.5 正交試驗 按L9（34） 正交表設(shè)計試驗, 加權(quán)評分法設(shè)定落新婦苷、 芍藥苷含有量和干膏得率的加權(quán)系數(shù)分別為0.5、 0.4、 0.1, 綜合評分=（落新婦苷含有量/最大值×0.5+芍藥苷含有量/最大值×0.4+干膏得率/最大值×0.1） ×100。 結(jié)果見表4, 方差分析見表5。

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表4 可知, 各因素影響程度依次為B＞C＞A；由表5 可知, 因素B 有顯著影響（P＜0.05）, 而因素A、 C 無顯著影響（P＞0.05）。 從生產(chǎn)實際、 節(jié)約成本角度考慮, 確定最優(yōu)工藝為A1B3C1, 即加8倍量水提取3 次, 每次1 h。

2.6 驗證試驗 按處方比例稱取藥材, 以優(yōu)化工藝進行3 批驗證實驗, 結(jié)果見表6, 可知工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 提取工藝選擇 痛風(fēng)泰顆粒由7 味藥材組成,以水溶性成分為主, 如秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類[13], 山茱萸主要含有熊果酸、 馬錢苷、 總多糖、有機酸等[14]。 考慮到各成分溶解性能和生產(chǎn)成本,本實驗選擇水煎煮提取。

表6 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

3.2 評價指標(biāo)與權(quán)重選擇 痛風(fēng)泰顆粒中君藥山慈菇有清熱解毒、 消腫散結(jié)之功效, 其主要藥效成分秋水仙堿對痛風(fēng)有特效, 但不良反應(yīng)及副作用大[15], 結(jié)合該藥材在全方中所占比例及該成分在該藥材中含有量, 未將其作為評價指標(biāo), 為本實驗不足之處, 會在后續(xù)制劑標(biāo)準(zhǔn)研究中加以改進。 本實驗以土茯苓中落新婦苷含有量, 赤芍中芍藥苷含有量、 干膏得率為評價指標(biāo), 與2015 年版《中國藥典》 藥材標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)指標(biāo)成分一致, 有利于從原料到制劑的全面控制, 保證臨床用藥安全性和有效性。

權(quán)重系數(shù)確定的方法有專家打分法、 主成分分析法、 模糊綜合評價法、 層次分析法、 CRITIC 法等[16-17], 其中前4 種方法主觀性較強, 而CRITIC法能體現(xiàn)客觀數(shù)據(jù)。 本實驗首先采用AHP 法量化評價指標(biāo)間比較判斷的優(yōu)先信息, 得到主觀權(quán)重系數(shù), 再采用CRITIC 法, 以評價指標(biāo)間的對比強度及沖突性為基礎(chǔ), 得到客觀權(quán)重系數(shù), 該方法既注重客觀性, 又不失主觀性。

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實驗首先選擇甲醇-0.1%冰醋酸（39 ∶61） 流動相, 結(jié)果只能分離出落新婦苷； 再選擇乙腈-0.1% 磷酸 （14 ∶ 86） 流動相[18-19], 發(fā)現(xiàn)能同時分離出芍藥苷和落新婦苷。然后, 通過增加乙腈比例、 調(diào)整柱溫和體積流量、更換色譜柱, 解決了落新婦苷峰形差、 出峰時間長等問題, 并提高了芍藥苷分離度。 2015 年版《中國藥典》 分別采用291、 230 nm 波長對落新婦苷、芍藥苷進行檢測, 本實驗為了避免波長切換, 簡化方法, 在結(jié)合相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上考察230 nm 波長處落新婦苷出峰情況[20], 發(fā)現(xiàn)其色譜峰有良好的響應(yīng)值, 方法確切可行, 故選擇該波長同時檢測落新婦苷和芍藥苷。