UPLC 法同時(shí)測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中9 種成分

廖小芳， 畢曉黎， 胥愛麗， 袁春平， 李養(yǎng)學(xué)， 高永堅(jiān)

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州510405； 2. 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院， 廣東 廣州510095； 3. 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州510095； 4. 國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山528303）

玉屏風(fēng)顆粒源于元代《丹溪心法》 中的玉屏風(fēng)散, 是治療表虛自汗的經(jīng)世名方, 由黃芪、 炒白術(shù)、 防風(fēng)組成, 主要功效為益氣、 固表、 止汗, 一般用于表虛不固、 自汗惡風(fēng)、 面色皓白或體虛易感風(fēng)邪者。 黃芪、 炒白術(shù)、 防風(fēng)含有豐富的化學(xué)成分, 具有廣泛的藥理活性[1-7], 其中黃芪主要含多糖、 皂苷、 黃酮類成分, 具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、 抗病毒、 抗應(yīng)激功效等作用[8]； 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷具有解熱、 鎮(zhèn)痛、 清除自由基等作用[9]； 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有抗炎、 促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)等作用[10]。

目前, 對(duì)玉屏風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制主要集中在測(cè)定黃芪甲苷、 黃酮類單一成分的含有量, 尚無多成分同時(shí)測(cè)定的報(bào)道[11-15]。 因此, 本實(shí)驗(yàn)通過UPLC法同時(shí)測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基維斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含有量, 為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC?色譜儀（美國(guó)Waters 公司）； XS205DU 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-700DE 臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； AdevantageA10自動(dòng)型純水機(jī)（美國(guó)Milli-Q 公司）； JP-150A 高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥 升麻素苷（批號(hào)S-004-180110）、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)111920-201203）、升麻素（批號(hào)S-007-170426）、 5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)J-002-170731）、 芒柄花苷（批號(hào)M-013-160906）、 毛蕊異黃酮（批號(hào)M-021-170614）、亥茅酚苷（批號(hào)C-018-171217）、 芒柄花素（批號(hào)C-018-171217）、 白 術(shù) 內(nèi) 酯Ⅲ （ 批 號(hào) 111978-201501） 對(duì)照品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院或成都瑞芬思生物科技有限公司。 乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）； 甲醇為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）； 液相用水為超純水。 4 批玉屏風(fēng)顆粒由國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司提供, 批號(hào)171102、171219、 180111、 180203。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm, 1.8 μm）； 流動(dòng)相乙腈-水, 梯度洗脫, 程序見表1； 體積流量0.20 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm； 進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 供試品溶液制備 精密稱取顆粒約0.5 g, 置于50 mL 具塞錐形瓶中, 精密加入10 mL 75% 甲醇, 稱定質(zhì)量, 超聲（700 W、 50 kHz） 45 min,放冷, 75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量, 0.22 μm 微孔濾膜過濾, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量,加甲醇制成分別含升麻素苷657.500 μg/mL、 毛蕊異 黃 酮-7-O-β-D-葡 萄 糖 苷431.040 μg/mL、 升麻素506.370 μg/mL、 5-O-甲 基 維 斯 阿 米 醇 苷539.940 μg/mL、 芒柄花苷551.170 μg/mL、 毛蕊異黃酮591.210 μg/mL、 亥茅酚苷502.23 μg/mL、芒柄花素260.530 μg/mL、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ98.010 μg/mL的溶液, 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例及制劑工藝,分別制成缺黃芪、 炒白術(shù)、 防風(fēng)的陰性樣品, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備, 即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品貯備液適量, 置于10 mL 量瓶中, 甲醇稀釋至刻度, 搖勻,制得系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液, 各精密吸取1 μL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸, 結(jié)果見表2, 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 專屬性考察 精密吸取供試品 （批號(hào)171102）、 對(duì)照品、 陰性樣品溶液, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 結(jié)果見圖1。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品 （批號(hào)171102）, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次, 測(cè)得升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積RSD 分別為0.47%、 0.57%、 0.29%、 1.05%、 1.03%、1.22%、 1.41%、 0.66%、 0.54%, 表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品 （批號(hào)171102）, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、升麻素、 5-O-甲基維斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含有量RSD 分 別 為 0.65%、 1.74%、 1.07%、 0.87%、1.57%、 0.51%、 1.70%、 3.39%、 1.93%, 表 明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品 （批號(hào)171102）, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.1” 色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-Oβ-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基維斯阿米醇苷、芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積RSD 分別為0.19%、 1.66%、0.27%、 0.85%、 0.89%、 1.03%、 1.89%、 1.31%、0.82%, 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品（批號(hào)171219） 約0.25 g, 共6 份, 置于50 mL 量瓶中, 加入各對(duì)照品適量, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算回收率。 結(jié)果, 升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、 5-O-甲基維斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、 亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均加樣回收率分別為100.75%、102.87%、 101.89%、 100.03%、 101.30%、 106.82%、96.40%、 103.94%、 99.77%, RSD 分 別 為3.48%、3.42%、 2.52%、 3.02%、 2.72%、 2.22%、 3.85%、3.25%、 2.14%。

2.5.7 樣品含有量測(cè)定 取4 批顆粒, 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算含有量, 結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g， n=2）Tab.3 Results of content deterrmination of various constituents （mg/g， n=2）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將供試品溶液在190 ～400 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描, 發(fā)現(xiàn)220 nm 下色譜峰數(shù)目、 豐度、 分離度較好, 故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 然后, 依次考察了提取方式（浸泡、 超聲處理、 加熱回流）、 提取溶劑（50% 甲醇、 75% 甲醇、 甲醇、 乙醇、 水）、提取時(shí)間 （30、 45、 60 min）、 柱 溫 （25、 30、35 ℃）、 體積流量（0.18、 0.20、 0.22 mL/min）、流動(dòng)相（乙腈-水、 乙腈-0.02% 甲酸、 甲醇-水）、色譜柱（ACQUITY UPLC?HSS T3 柱、 Phenomenex Luna Omaga 柱、 ACQUITY UPLC?BEH C18柱）, 發(fā)現(xiàn) 在ACQUITY UPLC?BEH C18色 譜 柱、 柱 溫30 ℃、 體積流量0.20 mL/min、 流動(dòng)相乙腈-水條件下75%甲醇提取45 min 時(shí), 各成分色譜峰的峰形、 分離度較好。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC 法同時(shí)測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中升麻素苷、 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、 升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、 芒柄花苷、 毛蕊異黃酮、亥茅酚苷、 芒柄花素、 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含有量, 該方法簡(jiǎn)便、 快速、 準(zhǔn)確, 對(duì)全面控制該制劑質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。