忍冬藤膠囊的制備及其質量標準

徐英輝， 申 茹， 郭玉巖

（1. 惠州衛生職業技術學院， 廣東 惠州516000； 2. 黑龍江中醫藥大學， 黑龍江 哈爾濱150040）

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥莖枝, 具有清熱解毒、 疏風通絡功效, 用于溫病發熱、 熱毒血痢、 癰腫瘡瘍、 風濕熱痹、 關節紅腫熱痛[1], 始見于梁代《名醫別錄》,四季均可用藥, 資源豐富[2], 其有效成分綠原酸、咖啡酸有顯著的抗菌、 抗病毒作用[3-6], 馬錢苷具有抗炎作用[7-8]。 課題組前期以綠原酸、 馬錢苷為指標, 優化忍冬藤提取工藝[9]； 本實驗在此基礎上, 以休止角、 堆密度、 吸濕率[10]為指標, 對忍冬藤膠囊的制備工藝進行研究, 并對其進行質量控制, 以期為今后工業化生產提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； HH-8 數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）； JA3003 電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）； BPG-9240A 鼓風干燥箱（上海百典儀器設備有限公司）； PS-40A 超聲波清潔機（深圳市科潔超聲科技有限公司）； ZF-7 暗箱三用紫外分析儀（上海和勤分析儀器有限公司）；AS-400 手工膠囊填充板（浙江奧爾特機械有限公司）； BZF-50 真空干燥箱 （上海博迅實業有限公司）。

1.2 試藥 藥用乳糖、 淀粉、 糖粉、 微晶纖維素（山東聊城華陽醫藥輔料有限公司）； 1 號空心膠囊（吉林敖東順合膠囊有限公司）。 忍冬藤 （批號160601） 購自亳州市宏大中藥飲片有限公司, 產地山東, 經惠州衛生職業技術學院中藥教研室祁銀德副教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥莖枝。 綠原酸（批號170309）、 馬錢苷（批號170308） 對照品購自北京世紀奧科生物技術有限公司。 甲醇、 乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 制備工藝

2.1 輔料篩選 以濃縮稠膏進行減壓干燥時發現,干燥后呈塊狀黏連固體, 而且容易吸潮, 不利于膠囊劑填充, 故選擇濕法制顆粒。

2.1.1 單一輔料 取稠膏5 g, 加入一定量的淀粉、 微晶纖維素、 乳糖、 糖粉混合制粒, 以休止角、 吸濕性、 綠原酸及馬錢苷含有量、 成型狀態為考察指標進行篩選, 結果見表1。 由表可知, 以上輔料均符合流動性與吸濕性的要求, 其中微晶纖維素流動性最好, 乳糖吸濕性最好, 微晶纖維素成分含有量最高, 而在輔料用量方面, 糖粉用量最大,可排除； 淀粉用量稍大, 但價格低廉； 微晶纖維素用量較少, 但其成本高, 不利于產業化。 綜合考慮, 需將輔料混合后作進一步考察。

表1 單一輔料考察結果Tab.1 Results of single excipient investigation

2.1.2 混合輔料 取稠膏5 g, 加入不同比例混合的微晶纖維素、 淀粉、 乳糖制備濕顆粒, 以休止角、 吸濕性、 綠原酸及馬錢苷含有量、 成型狀態為考察指標進行篩選, 結果見表2。 由表可知, 不同比例下顆粒休止角均小于30°, 顆粒流動性較好,符合吸濕性制劑要求, 其中微晶纖維素與淀粉混合時輔料用量少, 顆粒成型性好； 隨著微晶纖維素中淀粉量提高, 輔料用量隨之增加, 綠原酸、 馬錢苷含有量隨之降低, 其中微晶纖維素-淀粉比例為3 ∶1時兩者含有量最高, 而且顆粒適中。 綜合考慮有效成分含有量和患者服用量, 最終選擇混合輔料為微晶纖維素-淀粉（3 ∶1）, 稠膏與輔料的比例約為1 ∶1.1。

表2 混合輔料考察結果Tab.2 Results of mixed excipient investigation

2.2 膠囊型號篩選

2.2.1 堆密度 精密稱取3 份顆粒（質量m）, 填充于10 mL 量筒中, 由5 cm 高度落在木板上, 反復振動3 次后測定體積（V）, 根據公式ρ=m/V 計算 堆 密 度, 測 得 其 分 別 為 0.374、 0.380、0.374 g/mL, 平均0.376 g/mL （RSD=0.921%）。

2.2.2 膠囊裝量 《中國藥典》 規定, 忍冬藤用量為9 ～30 g, 綠原酸、 馬錢苷含有量均不低于0.10%, 以此折算, 2 種成分用量為9 ～30 mg, 每天服用9～18 粒。 結合“2.2.1” 項下結果, 根據膠囊殼型號和近似容積的關系, 選擇1 號空心膠囊（近似容積為0.5 mL） 分裝, 每粒裝約0.18 g。

2.3 驗證試驗 稱取藥材粗粉400 g, 按優化工藝進行提取, 提取液在80 ℃下減壓濃縮至相對密度為1.27 的稠膏備用, 取10、 20、 50 g, 加入混合輔料（微晶纖維素-淀粉, 3 ∶1）, 混合制粒, 考察工藝穩定性, 結果見表3, 可知所得顆粒成形性理想, 大小適中, 而且工藝穩定性好, 操作簡便。

表3 驗證實驗結果Tab.3 Results of verification tests

2.4 制備工藝 取藥材粗粉400 g, 按優化工藝提取, 80 ℃下減壓濃縮, 得稠膏約105 g, 相對密度為1.27, 加入混合輔料 （微晶纖維素-淀粉,3 ∶1） 120 g, 制粒, 干燥, 裝入膠囊即得, 制成1 000粒。

3 質量標準

3.1 TLC 定性鑒別

3.1.1 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 馬錢苷對照品適量, 50%甲醇溶解, 制成每l mL 分別含兩者0.3、 0.57 mg 的溶液, 即得。

3.1.2 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內容物0.5 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過, 取續濾液, 即得。

3.1.3 對照藥材溶液制備 精密稱取對照藥材1 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過,取續濾液, 即得。

3.1.4 空白輔料溶液制備 按照處方制備空白輔料并精密稱取0.5 g, 加入10 mL 50%甲醇超聲處理30 min, 濾過, 取續濾液, 即得。

3.1.5 鑒別方法 按照薄層色譜法（通則0502）試驗[11], 吸取空白輔料、 供試品、 對照藥材、 對照品溶液各5 μL, 在同一硅膠G 薄層板上點樣,以乙酸丁酯-甲醇-甲酸-水（7 ∶1 ∶2 ∶1） 為展開劑, 展開, 取出, 晾干, 在紫外光燈 （365 nm）下檢視, 再噴以10%硫酸乙醇溶液, 于105 ℃烘箱中加熱, 斑點顯色清晰后停止, 在日光下檢視薄層板, 結果見圖1。 由圖可知, 對照藥材、 對照品、供試品色譜對應位置上顯相同顏色的熒光斑點或斑點, 陰性無干擾。

3.2 檢查 按照2015 年版《中國藥典》 四部通則膠囊劑項下規定, 對膠囊進行水分、 裝量差異、崩解時限、 微生物限度檢查。

3.2.1 水分 取3 批膠囊, 每批10 粒, 依法檢查[11], 發現均符合《中國藥典》 規定, 見表4。

3.2.2 裝量差異 取3 批膠囊, 每批20 粒, 依法檢查[11], 發現均符合《中國藥典》 規定, 見表4。

圖1 樣品TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of samples

3.2.3 崩解時限 取3 批膠囊, 每批3 粒, 依法檢查[11], 發現均符合《中國藥典》 規定, 見表4。

表4 抽樣檢查結果Tab.4 Results of sampling inspection

3.3 含有量測定

3.3.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A 色譜柱（4.0 mm×250 mm, 5 μm）； 流動相0.04%磷酸-乙腈, 梯度洗脫 （0 min, 88.5 ∶ 11.5； 14 min, 85 ∶ 15；20 min, 69 ∶31； 23 min, 10 ∶ 90）； 檢 測 波 長240 nm （馬錢苷）、 327 nm （綠原酸）； 體積流量0.6 mL/min； 柱溫20 ℃； 進樣量5 μL。

3.3.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 馬錢苷對照品適量, 50%甲醇溶解, 制成每l mL 分別含兩者0.51、 0.7 mg 的溶液, 即得。

3.3.3 供試品溶液制備 精密稱取膠囊內容物約0.5 g, 置于具塞錐形瓶中, 加入50%甲醇25 mL,稱定質量, 超聲（功率250 W、 頻率30 kHz） 處理30 min, 放冷, 再稱定質量, 50%甲醇補足減失質量, 搖勻, 濾過, 取續濾液, 即得。

3.3.4 陰性樣品溶液制備 取不含藥材提取液的空白輔料顆粒0.5 g, 按“3.3.3” 項下方法制備,即得。

3.3.5 系統適用性試驗 取對照品、 樣品、 陰性樣品溶液, 在“3.3.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖2, 可知各成分均能得到較好的分離, 陰性無干擾。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

3.3.6 線性關系考察 取綠原酸對照品母液, 依次 稀 釋 至 10.2、 25.5、 51、 127.5、 255、306 μg/mL, 在“3.3.1” 項色譜條件下各 進 樣5 μL測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）, 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸, 得方程Y=23 026X-57.274 （r=0.999 7）, 在10.2～306 mg/mL 范圍內線性關系良好。

取馬錢苷對照品母液, 依次稀釋至7、 14、35、 70、 140、 245、 525 μg/mL, 在 “3.3.1” 項色譜條件下各進樣5 μL 測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）, 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸,得方程Y=11 345X-11.359 （r=0.999 9）, 在7 ～525 mg/mL 范圍內線性關系良好。

3.3.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液, 于0、2、 4、 8、 12、 24 h 在“3.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得綠原酸、 馬錢苷峰面積RSD 分別為0.24%、 0.14%, 表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3.3.8 精密度試驗 精密吸取供試品溶液5 μL,在“3.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次, 測得綠原酸、 馬錢苷峰面積RSD 分別為0.11%、 0.17%,表明儀器精密度良好。

3.3.9 重復性試驗 精密稱同一批供試品約0.5 g, 共6 份, 按“3.3.3” 項下方法制備供試品溶液, 在“3.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得綠原酸、 馬錢苷含有量RSD 分別為1.54%、 1.47%,表明該方法重復性良好。

3.3.10 加樣回收率試驗 取含有量已知的同一膠囊9 份, 加入對照品溶液（綠原酸0.6 mg/mL、 馬錢苷1.3 mg/mL）, 按“3.3.3” 項下方法制備供試品溶液, 在“3.3.1” 項色譜條件下進樣5 μL測定, 計算回收率, 結果見表5～6。

表5 綠原酸加樣回收率試驗結果Tab.5 Results of recovery tests for chlorogenic acid

3.3.11 樣品含有量測定 取5 批膠囊內容物, 每批0.5 g, 按” 3.3.3” 項下方法制備供試品溶液,吸取對照品、 供試品溶液各5 μL, 在” 3.3.1” 項色譜條件下進樣測定, 計算含有量, 結果見表7。

4 討論

本實驗對薄層色譜條件進行篩選時, 采用乙酸丁酯-甲酸-水體系, 發現馬錢苷、 綠原酸Rf值分別為0.088、 0.188, 分離度不高； 展開體系中有丙酮、 甲醇等極性溶劑可提高Rf值, 但加入前者時極性過大, 分離度不高, 拖尾現象嚴重, 展開時間較長, 而加入后者時成分分離度良好, 最終確定乙酸丁酯-甲醇-甲酸-水（7 ∶1 ∶2 ∶1） 作為展開條件。 然后, 對不同點樣量 （3、 5、 8、 10 μL）進行考察, 發現點樣量越大條帶越明顯, 但超過5 μL時會影響分離效果, 故選擇5 μL。 接著, 對不同條帶寬度（2、 4、 6、 8、 10 mm） 進行考察,發現條帶越小, 色譜圖越窄, 不能較好分離, 故選擇10 mm。 再對展開距離、 溫度、 濕度進行考察,發現三者對薄層色譜圖均無明顯影響。

表7 各成分含有量測定結果Tab.1 Results of content determination of various constituents

本實驗對HPLC 色譜條件進行篩選時, 考察流動相甲醇-0.04% 磷酸、 乙腈-0.1% 甲酸、 乙腈-0.04%磷酸, 發現乙腈-0.04% 磷酸洗脫時有效成分分離效果最好, 再對其進行優化, 確定梯度洗脫比例。 結果顯示, 綠原酸、 馬錢苷保留時間適當,峰形良好, 分離度高。