HPLC 法同時測定新會柑種子中7 種成分

鄭國棟， 楊秀娟， 巢穎欣， 胡坪君， 陳柏忠， 蔡 軼， 韋敏燕*

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州511436； 2. 廣東新寶堂生物科技有限公司， 廣東 江門529000）

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮, 作為藥食同源的材料, 主要包括廣陳皮、 川陳皮、 浙陳皮、 建陳皮和贛陳皮。 其中廣陳皮為茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ （新會柑或大紅柑）的干燥成熟果皮[1], 主產(chǎn)于江門市新會地區(qū), 為廣東省十大道地藥材之一, 也是首批立法保護(hù)的8種嶺南中藥材之一, 具有理氣健脾、 和胃止嘔、 燥濕化痰等功效[2]。

廣陳皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速, 僅新會當(dāng)?shù)亟y(tǒng)計(jì), 2017年廣陳皮的種植規(guī)模已達(dá)7 萬畝, 總產(chǎn)柑果超8.5萬噸, 扣除果皮后果肉年產(chǎn)近6 萬噸, 果籽近2 000噸。 盡管果肉與果籽產(chǎn)量極大, 但對新會柑的應(yīng)用主要集中于果皮。 由于其柑肉味酸籽多, 故其果肉和果籽的處理方式通常為挖土掩埋或是直接扔入溝渠等露天場所, 不僅造成了極大的資源浪費(fèi), 也對環(huán)境造成了污染。

將柑橘果籽（種子） 作為中藥橘核Citrus reticulata Semen 應(yīng)用, 其具有理氣、 散結(jié)、 止痛等功效[3]。 現(xiàn)代藥理研究表明, 橘核還具有鎮(zhèn)痛、 抗癌以及抗感染等藥理活性[4]。 課題組對新會柑果皮（廣陳皮） 的化學(xué)成分、 藥理活性以及質(zhì)量控制等已作了大量研究[5-8], 但國內(nèi)外尚無新會柑果籽（種子） 的相關(guān)研究報道。 因此, 為了更好地開發(fā)利用新會柑, 本研究首次建立了HPLC 法同時測定新會柑種子中7 種成分, 以期為其資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）； UV 2300 紫外-可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）； MS205DU 分析天平（十萬分之一, 瑞士梅特勒-托利多公司）； 超聲波清洗機(jī)KQ-800KDE （昆山市超聲儀器有限公司）。

新會柑柑果采至廣東省江門市新會區(qū), 由廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蔡軼副教授鑒定為蕓香科柑橘屬茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi’ 的果實(shí), 經(jīng)剝離果皮, 收集種子, 洗凈、 曬干得干燥成熟種子, 其樣品保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。 信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

辛弗林 （批號MUST-17041915）、 沒食子酸（批號MUST-17022801）、 橙皮苷 （批號 MUST-15070211）、 檸檬苦素 （批號MUST-17030220）、川陳皮素（批號MUST-15110911）、 橘皮素（批號MUST-151110912, 含有量≥98%） 均購于成都曼思特生物科技有限公司； 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮（批號151123, 含有量≥98%, 四川維克奇生物科技有限公司）。 乙腈（色譜純, 含有量≥98%美國霍尼韋爾公司）； 甲醇、 乙酸乙酯均為分析純； 水為怡寶純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測定7 種成分含有量

2.1.1 供試品溶液 分別稱取4 批新會柑種子適量, 打粉, 粉末過3 號篩, 精密稱取粉末0.2 g 于100 mL 錐形瓶中, 加入20 mL 甲醇, 超聲提取（320 W、 40 kHz） 30 min, 過濾, 即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取一定量的7 種對照品至50 mL 量瓶中, 加甲醇溶解并定容, 使制成質(zhì)量濃度分別為辛弗林37.560 μg/mL、 沒食子酸1.200 μg/mL、 橙皮苷341.700 μg/mL、 檸檬苦素392.980 μg/mL、 川陳皮素71.040 μg/mL、 3, 5,6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮9.960 μg/mL 和橘皮素49.320 μg/mL 的混合對照品貯備液, 冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?臨用前, 加甲醇稀釋至適宜濃度, 即得。2.1.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相磷酸水（A） -（甲醇∶乙腈=1 ∶1, B）, 梯度洗脫, 程序見表2；檢測波長辛弗林（224 nm）, 沒食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 檸檬苦素（209 nm）, 川陳皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮、 橘皮素（330 nm）； 柱溫30 ℃； 體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 波長選擇 分別精密稱取一定量7 種對照品于量瓶中, 加入甲醇溶解并定容, 備用。 以甲醇為空白對照溶液, 在190～900 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 以對照品溶液和供試品溶液均有較大吸收為指標(biāo)選擇測定波長, 最終7 種成分的檢測波長分別確定為辛弗林（224 nm）, 沒食子酸（218 nm）,橙皮苷（283 nm）, 檸檬苦素（209 nm） 和川陳皮素、 3, 5, 6, 7, 8, 3′, 4′-七甲氧基黃酮、 橘皮素（330 nm）。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品貯備液, 加入甲醇稀釋, 配制成6 個質(zhì)量濃度水平。 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析, 每個樣品重復(fù)測3 次。 分別以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 結(jié)果見表3。檢測限（LOD） 和定量限（LOQ） 分別是當(dāng)信噪比（S/N） 為3 和10 時化合物的質(zhì)量濃度。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 分別選取低、 中、 高3 個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣3 次, 測得7 種成分RSD 分別為1.0%、 1.7%、 1.7%、 0.4%、 1.2%、 0.5% 和1.1%, 表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇第S1 批樣品, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下, 于0、 2、 4、 8、 12、 24、 48 h 進(jìn)樣, 測得7 種成分RSD 分別為0.7%、 1.3%、0.5%、 2.3%、 1.4%、 0.3% 和0.2%, 表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取第S1 批的新會柑種子粉末, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測得7 種成分的含 有 量 分 別 為0.041、 0.004、 0.423、 20.480、0.405、 0.069、 0.303 mg/g； RSD 分別為1.2%、2.2%、 0.5%、 2.5%、 1.9%、 0.5% 和0.2%, 表明該方法重復(fù)性良好。

表3 各成分線性關(guān)系（n=3）Tab.3 Linear relationships of various constituents （n=3）

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的第S1 批新會柑種子粉末6 份, 每份0.2 g, 分別加入一定量的混合對照品, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測定7 種成分含有量, 計(jì)算加樣回收率。 7 種成分平 均 回 收 率 分 別 為 98.546%、 101.703%、100.298%、 98.719%、 101.769%、 100.516%、100.032%； RSD 分 別 為 2.1%、 2.6%、 1.5%、1.5%、 1.5%、 1.3%、 2.0%。

2.1.10 樣品含有量測定 分別精密稱取4 批新會柑種子粉末各0.2 g, 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 分別取適量經(jīng)0.22 μm 針頭濾膜過濾, 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 測定結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （n=3）

2.2 UV 法測定總黃酮、 多甲氧基黃酮及總酚酸

2.2.1 總黃酮[9]分別稱取4 批新會柑種子適量,打粉, 粉末過3 號篩, 精密稱取粉末0.2 g, 加入20 mL 甲醇超聲（320 W、 40 kHz） 提取30 min,提取1 次, 以橙皮苷為對照, 在283 nm 波長處測定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得總黃酮含有量, 結(jié)果見表4。

2.2.2 多甲氧基黃酮[10]分別稱取4 批新會柑種子適量, 打粉, 粉末過3 號篩, 精密稱取粉末0.2 g, 加入20 mL 乙酸乙酯超聲（320 W、 40 kHz）提取30 min, 提取2 次, 合并2 次提取液, 以川陳皮素為對照, 在330 nm 波長處測定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得多甲氧基黃酮含有量, 結(jié)果見表4。

2.2.3 總酚酸[11]分別稱取4 批新會柑種子適量, 打粉, 粉末過3 號篩, 精密稱取粉末0.2 g,加入20 mL 甲醇超聲 （320 W、 40 kHz） 提取30 min, 提取1 次, 以沒食子酸為對照, 在765 nm波長處測定, 采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得總酚酸含有量, 結(jié)果見表4。

3 討論

在測定檸檬苦素的含有量時, 王巍靜、 羅靜等[12-13]采用石油醚等對其進(jìn)行脫脂處理。 考慮到脫脂處理會對低極性待測成分的含有量測定帶來干擾, 因此, 課題組采用超聲提取法, 直接用甲醇提取, 還比較了脫脂與否對檸檬苦素含有量測定的影響, 發(fā)現(xiàn)兩者并無顯著性差異。 因此, 本實(shí)驗(yàn)選用甲醇超聲提取。

已有研究[14]表明新會柑果皮（新會陳皮） 中以黃酮類成分為主, 其中以橙皮苷含有量最高。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明, 新會柑種子則以檸檬苦素類成分為主, 其具有抗菌、 抗炎、 鎮(zhèn)痛、 抗癌、 降壓等多種藥理活性[15-17], 因此, 可考慮從中提取檸檬苦素類成分, 對新會柑種子予以開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 除檸檬苦素外, 新會柑種子還含有部分辛弗林等生物堿類、 沒食子酸等酚酸類以及黃酮類成分。 辛弗林具有舒張氣管平滑肌、 肝保護(hù)及改善新陳代謝等作用[18-20]； 沒食子酸具有降脂、 抗菌等作用[21-22]； 黃酮類具有改善糖脂代謝、 抗氧化、 心肌保護(hù)等作用[23-24]。 本研究結(jié)果進(jìn)一步表明新會柑種子具有良好的藥理活性, 是1種有效的藥用資源。

致謝：衷心感謝新會區(qū)人民政府、 新會陳皮行業(yè)協(xié)會等單位在樣品采集及基地建設(shè)方面對本研究工作的大力支持和幫助。