一測多評(píng)法同時(shí)測定廣藿香中4 種成分

李小琪， 范燕豪， 陳 陽， 王婷婷， 侯劍偉， 尤麗莎

（上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海201203）

廣藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth. 是我國常用傳統(tǒng)中藥, 多用于治療濕濁中阻、 脘痞嘔吐、 暑濕倦怠、 腹痛吐瀉及頭痛等[1]。 其原產(chǎn)東南亞, 后傳入中國, 最初作香料使用, 后來在嶺南一帶普遍種植, 目前在高要、 肇慶、 陽江、 湛江和海南等地區(qū)均有栽培[2]。

廣藿香的化學(xué)成分主要集中在揮發(fā)油, 含有百秋李醇、 廣藿香酮、 廣藿香烯、 β-欖香烯、 愈創(chuàng)木烯、 石竹烯等[3-9]。 《中國藥典》 對(duì)廣藿香藥材及廣藿香油中百秋李醇的含有量進(jìn)行了規(guī)定。 研究表明[10-12], 廣藿香中廣藿香酮和石竹烯等也是其抗真菌、 抗病毒的主要成分。 因此, 本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法[13-16]同時(shí)測定廣藿香中β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮的含有量, 以期為全面控制廣藿香藥材的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 6890 N、 Agilent 7890B 氣相色譜儀（美國安捷倫公司）； Agilent DB-1、 Agilent DB-5、 Agilent HP-5 毛細(xì)管柱 （30 m×0.25 mm,0.25 μm, 美國安捷倫公司）； ME204/02 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司]；SB-5200D-250 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； 粉碎機(jī)（上海廣沙工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥 β-欖香烯（批號(hào)100268-200401） 購自中國食品藥品檢定研究院； β-石竹烯 （批號(hào)S09J9I51386）、 百秋李醇 （批號(hào)Z16A9X58775）、廣藿香酮（批號(hào)P11A8F33626） 均購自上海源葉生物科技有限公司； 正十八烷（批號(hào)20160627）、二氯甲烷（批號(hào)20170823） 和色譜純正己烷（批號(hào)18010072） 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

收集了21 批不同產(chǎn)地的廣藿香藥材, 記為S1～S21。 其中S1、 S8、 S16 ～S18 產(chǎn)地為廣東肇慶高要祿步； S2～S3、 S10～S13 產(chǎn)地為廣東肇慶高要河臺(tái)； S7、 S14 ～S15 產(chǎn)地為廣東肇慶德慶武壟；S4～S6、 S9 產(chǎn)地為廣東肇慶高要樂城； S19 產(chǎn)地為廣東陽江陽春潭水； S20 產(chǎn)地為廣東茂名高州；S21 產(chǎn)地為海南萬寧。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm, 0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃； 20 ∶1 分流進(jìn)樣； 初始溫度100 ℃, 保持1 min, 5 ℃/min 的速率升溫至140 ℃, 保 持5 min, 3 ℃/min 的 速 率 升 溫 至190 ℃, 10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃, 保持2 min； 體積流量0.7 mL/min。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of various constituents

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取β-欖香烯、β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮對(duì)照品適量, 正己烷溶解, 制成對(duì)照品貯備液, 質(zhì)量濃度分別為2.709、 3.360、 19.26、 14.27 mg/mL。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取適量正十八烷, 用正己烷溶解制成內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度15.020 mg/mL）。

2.4 混合對(duì)照品溶液制備 各精密量取β-欖香烯、 β-石 竹 烯、 百 秋 李 醇、 廣 藿 香 酮 貯 備 液2.5 mL, 混勻, 定容至10 mL 量瓶, 即得。

2.5 供試品溶液制備 精密稱定廣藿香藥材粗粉3.0 g, 加50 mL 二氯甲烷, 超聲處理 （每次20 min, 共3 次）, 過濾, 合并濾液, 回收溶劑至干, 正己烷溶解殘?jiān)? 轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶, 精密加入0.5 mL 內(nèi)標(biāo)溶液, 加正己烷定容, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液3.50、 2.50、 1.50、 1.00、 0.50、 0.20 mL 于5 mL 量瓶, 加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL, 用正己烷定容得到系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液。 各精密吸取1 μL, 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣, 以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.2 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 分別取高、 中、 低濃度的混合對(duì)照品溶液, 在 “2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣6次, 并與內(nèi)標(biāo)峰面積比較。 測得β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮精密度RSD 分別為0.56%、 0.58%、 0.47%、 0.53%, 表明儀器日內(nèi)精密度良好。

2.6.3 日間精密度試驗(yàn) 分別取高、 中、 低濃度的混合對(duì)照品溶液, 連續(xù)3 d, 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣3 次, 并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積作比較。 測得β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮的精密度RSD 分別為0.52%、 0.55%、 0.49%、 0.46%,表明儀器日間精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定3.0 g 廣藿香藥材粗粉（S2）, 按“2.5” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份, 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣, 測得β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮平均含有量RSD 分別為1.00%、 1.56%、 0.76%、 0.83%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S2）,室溫放置, 在“2.1” 項(xiàng)條件下, 于0、 2、 4、 8、12、 24 h、 進(jìn)樣1 μL, 并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比較。測得β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮峰面積比值RSD 分別為0.14%、 0.27%、 0.27%、0.39%。 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取S2 樣品廣藿香藥材粗粉6 份, 每份1.5 g, 精密稱定, 每份樣品分別加入相應(yīng)對(duì)照品（百秋李醇10 mg、 廣藿香酮4.5 mg； 0.378 mg/mLβ-欖香烯1 mL； 1.025 mg/mL β-石竹烯1 mL）, 按“2.5” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份, 測得4 種成分的加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

2.7 相對(duì)校正因子計(jì)算 按照相對(duì)校正因子計(jì)算公式, 以百秋李醇為內(nèi)參物, 精密吸取1 μL 系列不同質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣, 記錄對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積, 計(jì)算其余3 種成分的相對(duì)校正因子。 結(jié)果見表3。

表3 各成分相對(duì)校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.8 重復(fù)性考察 取混合對(duì)照品溶液1 μL, 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣, 考察Agilent 6890 N 和Agilent 7890B 氣相色譜系統(tǒng), 以及Agilent DB-5、Agilent DB-1 （30 m × 0.25 mm, 0.25 μm） 和Agilent HP-5 （30 m×0.32 mm, 0.25 μm） 3 種色譜柱對(duì)廣藿香各成分相對(duì)校正因子的影響, 結(jié)果表明, 不同儀器及色譜柱對(duì)廣藿香各成分相對(duì)校正因子均無顯著影響, 見表4。

表4 不同儀器和色譜柱上相對(duì)校正因子Tab.4 Relative correction factors on different instruments and columns

2.9 色譜峰定位 取“2.5” 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液, 采用不同的色譜柱, 在不同的氣相色譜系統(tǒng)上, 測定并計(jì)算待測成分β-欖香烯、 β-石竹烯、廣藿香酮與內(nèi)參物百秋李醇間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留值。 結(jié)果顯示保留時(shí)間差法波動(dòng)較大, 用于廣藿香中待測成分的一測多評(píng)定位不合適。 而不同色譜柱和不同系統(tǒng)下, 各待測成分的相對(duì)保留值波動(dòng)較小, RSD≤1.93%, 重現(xiàn)性更好, 更適宜于一測多評(píng)中對(duì)廣藿香中待測成分進(jìn)行色譜峰定位, 見表5～6。

表5 不同儀器和色譜柱上不同氣相色譜系統(tǒng)測得的相對(duì)保留值Tab.5 Relative retention values on different instruments and columns

表6 不同儀器和色譜柱上保留時(shí)間差Tab.6 Differences in retention time on different instruments and columns

2.10 樣品含有量測定 取21 批不同產(chǎn)地樣品,按“2.5” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣, 采用一測多評(píng)法對(duì)廣藿香中β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮進(jìn)行含有量測定及計(jì)算。 同時(shí)采用t 檢驗(yàn)法對(duì)內(nèi)標(biāo)法含有量測定值與一測多評(píng)法的測定結(jié)果進(jìn)行比較, 見表7。結(jié)果表明, 2 種方法得到的β-欖香烯、 β-石竹烯、廣藿香酮含有量的P 值分別為0.85、 1.00、 0.95,差異不顯著性（P＞0.05）。 因此內(nèi)標(biāo)法和一測多評(píng)法測得的廣藿香中β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮含有量無顯著性差異。

3 討論

選擇一測多評(píng)內(nèi)標(biāo)參照物時(shí), 由于百秋李醇與廣藿香酮在廣藿香中含有量均較高, 但廣藿香酮的穩(wěn)定性在藥材中相對(duì)較低, 且價(jià)格較高, 而百秋李醇穩(wěn)定且價(jià)格較低, 因此本實(shí)驗(yàn)選擇了百秋李醇為QAMS 法的內(nèi)參物。

研究過程中, 考察了甲醇、 正己烷、 二氯甲烷等超聲提取溶劑, 甲醇、 正己烷等復(fù)溶溶劑, 考察各成分含有量, 結(jié)果表明, 使用二氯甲烷超聲提取、 正己烷復(fù)溶能使廣藿香各有效成分提取更完全。 因此最終選用二氯甲烷超聲提取以及正己烷復(fù)溶。

廣藿香藥材含有多種成分, 本實(shí)驗(yàn)以百秋李醇為內(nèi)參物, 首次建立了一測多評(píng)法同時(shí)測定廣藿香中β-欖香烯、 β-石竹烯、 百秋李醇、 廣藿香酮的含有量, 具有較高的重現(xiàn)性、 穩(wěn)定性, 不但可以節(jié)約成本, 而且還能與中藥現(xiàn)代化質(zhì)量控制更加吻合, 可以為廣藿香藥材進(jìn)行全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

表7 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g， n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg/g， n=3）