豨桐丸對尿酸鈉晶體誘導巨噬細胞NF-κB 活化的影響

賈 萍， 陳 剛

（1. 重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科， 重慶400016； 2. 重慶工商大學環境與資源學院制藥工程系， 重慶400067）

尿酸鹽晶體激發的炎癥是痛風核心病理特征[1], 它一旦在關節組織中形成, 則可通過與巨噬細胞、 中性粒細胞、滑膜成纖維細胞等細胞表面的Toll 樣受體（TLR） -2、 4 結合[2], 經過一系列信號轉導通路而激活NF-κB 抑制蛋白（IκB） 激酶（IKK） 使IκBα 降解, NF-κB 二聚體（主要是p65/p50） 游離后核移位, 與靶基因啟動子上κB 序列特異性結合, 啟動細胞因子、 粘附分子、 趨化因子等眾多炎癥介質基因的轉錄[3]。 因此, 調控NF-κB 活化被公認為是治療痛風的有效手段之一。

盡管現有抗痛風藥物療效確切, 但不良反應明顯, 因此從中醫藥中探尋有效、 不良反應小的方劑有重要意義[4]。 豨桐丸來源于《濟世養生集》 卷三, 具有祛風勝濕、 舒筋活絡之功效, 是中醫治療痹癥（痛風屬于中醫“痹癥” 范疇） 的經典常用方劑, 課題組前期發現它可抑制尿酸鹽誘導大鼠痛風性關節炎發展, 降低關節組織中白細胞介素-1β （IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 的表達[5]； 可抑制尿酸鹽誘導巨噬細胞Nod 樣受體蛋白3（NLRP3） 炎性體活化, 以及巨噬細胞產生IL-1β 成熟體；還可抑制尿酸鹽誘導的巨噬細胞表達IL-1β 前體, 但其機制迄今仍不清楚。 因此, 本實驗選擇尿酸鹽誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞株, 觀察豨桐丸對IL-1β 表達、 IκBα降解、 p65 蛋白核轉移、 NF-κB 與DNA 結合活性的影響,以期闡明該制劑拮抗痛風炎癥發展的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株RAW264.7購自中國科學院細胞庫。

1.2 試藥 豨薟草、 臭梧桐葉均購自重慶桐君閣股份有限公司, 經西南大學藥學院張繼芬副教授鑒定為正品。 IL-1β酶聯免疫檢測試劑盒（美國R＆D 公司, 批號673827）； 金絲桃苷、 奇壬醇對照品（四川省維克奇生物科技有限公司, 批號201018、 201153）； 秋水仙堿（美國Sigma 公司,批號1002048038）； ECL 試劑（美國Milipore 公司, 批號1331501）； p65、 IκBα、 β-actin、 Lamin B1 抗 體 （美 國Santa Cruz 公 司, 批 號B2125、 F2014、 C2011、 B2255）；RIPA 裂解液 （上海碧云天生物科技有限公司, 批號110317180212）； p65 與DNA 結合活性檢測試劑盒（美國Active Motif 公司, 批號521478932）。

1.3 儀器 Infinite M200 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；ChemiDoc XRS 型成像系統（美國Bio-Rad 公司）； RC24 型高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific 公司）； Mill-iQ 型純水系統（美國Millipore 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 RAW264.7 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中（含100 U/mL 青霉素、 100 μg/mL 鏈霉素）, 37 ℃、 5%CO2下培養。

2.2 豨桐丸制備 取豨薟草、 臭梧桐葉各500 g, 置于10倍體積蒸餾水中浸泡1 h 后煮沸提取1 h, 重復3 次, 合并提取液, 經過濾、 濃縮并真空冷凍干燥后得到固體提取物,密封保存于-20 ℃下。 臨用前, 用DMEM 培養基配制成4 mg/mL母液, 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

2.3 尿酸鹽晶體制備[6]4 g 尿酸溶于800 mL 雙蒸水中,加熱溶液至60 ℃后用0.5 mol/L NaOH 溶液調節pH 至8.9, 4 ℃冰箱中過夜, 4 000 r/min 離心20 min, 收集沉淀, 即得, 高壓滅菌、 烘干。 臨用前, 在無菌條件下用DMEM 培養基配制成2 mg/mL 母液備用。

2.4 細胞活力檢測 采用MTT 法。 RAW264.7 細胞以1×104/孔的密度培養于96 孔板中, 24 h 后將細胞隨機分為對照組、 實驗組（25、 50、 100、 200、 400、 800 μg/mL）,繼續培養24 h。 加入MTT 至終質量濃度為0.5 mg/mL, 繼續培養4 h, 棄培養液, 每孔加入200 μL DMSO, 于570 nm波長處檢測吸光度, 計算細胞活力, 公式為細胞活力=（實驗組吸光度/對照組吸光度） ×100%。

2.5 細胞培養液中IL-1β 水平檢測 采用ELISA 法。RAW264.7 細胞以1×105/孔的密度培養于96 孔板中, 24 h后將細胞隨機分為對照組、 模型組（200 μg/mL）、 秋水仙堿組（陽性對照, 0.4 μg/mL 秋水仙堿+200 μg/mL 尿酸鹽, 臨用前用DMSO 溶解成200 mg/mL 母液, 最終培養體系中DMSO 終濃度為0.1%） 及豨桐丸低、 中、 高劑量組（100、 200、 400 μg/mL 豨桐丸+200 μg/mL 尿酸鹽）。 上述藥物預作用2 h 后, 加入尿酸鹽繼續培養18 h, 取細胞培養液, 12 000 r/min 離心5 min, 按照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測IL-1β 水平。

2.6 細胞總蛋白、 核蛋白提取制備 RAW264.7 細胞以1×105/孔的密度培養于96 孔板中, 24 h 后將細胞分為對照組、 模型組（200 μg/mL）、 秋水仙堿組 （陽性對照藥,0.4 μg/mL 秋水仙堿+200 μg/mL 尿酸鹽） 及豨桐丸低、中、 高劑量組（100、 200、 400 μg/mL 豨桐丸+200 μg/mL尿酸鹽）。 上述藥物預作用2 h 后, 加入尿酸鹽刺激30 min（用于IκBα 檢測） 或2 h （用于p65、 NF-κB 與DNA 的結合活性檢測）。 收集細胞, 冰預冷PBS 緩沖液（pH=7.4）洗滌3 次后, 按照文獻[7] 方法提取總蛋白（用于IκBα檢測） 或核蛋白（用于p65、 NF-κB 與DNA 的結合活性檢測）, 于-70 ℃下保存備用。 然后, BCA 法檢測蛋白濃度。

2.7 細胞中IκBα 表達及胞核中p65 表達檢測 采用Western blot 法。 取細胞總蛋白或核蛋白提取物, SDSPAGE 電泳后轉移蛋白至PVDF 膜, 5%脫脂奶粉于室溫下封閉1 h, 然后分別與IκBα、 p65、 β-actin、 Lamin B1 抗體在4 ℃下共同孵育過夜, 再與相應的Ⅱ抗于室溫下共同孵育1 h, 加入ELC 試劑顯影、 檢測。

2.8 p65 與DNA 結合活性檢測 取提取的胞核蛋白, 按照Trans AMTMNF-κB p65 活性檢測試劑盒說明書進行檢測,于450 nm 波長處測定吸光度。

2.9 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理, 數據以） 表示, 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 有顯著性差異。

3 結果

3.1 提取物制備 1 000 g 豨桐丸共得到固體提取物208 g,提取率20.8%。 HPLC 法測得奇壬醇、 金絲桃苷含有量分別為1.36、 0.22 mg/g。

3.2 豨桐丸對RAW264.7 細胞活力的影響 25 ～

400 μg/mL豨桐丸細胞活力與對照組比較均無顯著差異（P＞0.05）, 故本實驗確定劑量100、 200、 400 μg/mL。

3.3 豨桐丸對IL-1β 水平、 p65 與DNA 結合活性的影響表1 顯示, 與對照組比較, 模型組IL-1β 水平、 p65 與DNA 結合活性顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較, 豨桐丸（200、 400 μg/mL） 組兩者顯著降低 （P ＜0.05, P ＜0.01）。

表1 豨桐丸對IL-1β 表達、 p65 與DNA 結合活性的影響s， n=3）

表1 豨桐丸對IL-1β 表達、 p65 與DNA 結合活性的影響s， n=3）

注： 與對照組比較, **P ＜0.01；與模型組比較,＃P ＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 劑量/（μg·mL-1）IL-1β/（pg·mL-1）p65 與DNA結合活性對照組 — 12.4±1.1 0.16±0.04模型組 200 29.9±3.1** 1.2±0.18**秋水仙堿組 0.4 17.1±1.5＃＃ 0.36±0.11＃＃豨桐丸低劑量組 100 27.9±0.9 1.13±0.17豨桐丸中劑量組 200 23.9±1.7＃ 0.86±0.09＃豨桐丸高劑量組 400 19.9±1.6＃＃ 0.66±0.05＃＃

3.4 豨桐丸對IκBα、 p65 表達的影響 表2、 圖1 顯示,與對照組比較, 模型組IκBα 表達顯著降低（P ＜0.01）,p65 表達顯著升高（P ＜0.01）； 與模型組比較, 豨桐丸（200、 400 μg/mL） 組前者表達顯著升高（P＜0.01）, 后者表達顯著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

表2 豨桐丸對IκB、 p65 表達的影響， n=3）

表2 豨桐丸對IκB、 p65 表達的影響， n=3）

注：與對照組比較, **P ＜0.01；與模型組比較,＃ P ＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 劑量/（μg·mL-1）IκBα/β-actin p65/Lamin B1對照組 — 0.14±0.02 0.51±0.12模型組 200 0.01±0.002** 2.98±0.19**秋水仙堿組 0.4 0.11±0.02＃＃ 0.81±0.1＃＃豨桐丸低劑量組 100 0.01±0.003 3.04±0.14豨桐丸中劑量組 200 0.06±0.02＃＃ 2.41±0.11＃豨桐丸高劑量組 400 0.09±0.03＃＃ 1.21±0.18＃＃

4 討論

大量研究證實了IL-1β 在痛風炎癥過程中的關鍵作用[8], 它可促進中性粒細胞向尿酸鹽沉積的部位遷移, 從而誘導痛風急性發作； 也可激活多種炎性細胞中的轉錄因子NF-κB, 誘導大量炎性介質基因, 如細胞因子、 黏附分子、 趨化因子等的轉錄； 還與關節局部破骨細胞活化、 神經元介導機體對炎性疼痛的過度敏感等病理變化密切相關[9]。 臨床試驗也表明, IL-1β 拮抗劑, 如rilonacept[10]、anakinra[11]和canakinumab[12]均表現出良好的抗痛風療效,故拮抗IL-1β 產生或功能被認為是治療痛風的有效手段。

圖1 各組IκB、 p65 表達

尿酸鹽誘導IL-1β 產生的分子機制已被基本闡述清楚[13], 關節局部沉積的尿酸鹽可被滑膜成纖維細胞、 巨噬細胞等識別而被吞噬, 該病理過程主要由TLR2/TLR4-MyD88 信號分子介導[14]。 當尿酸鹽刺激信號轉入細胞內后, 一方面可激活IKK, 使IκB 發生泛素化降解, 進而使p65 蛋白游離并進入細胞核, 最終誘導大量炎性介質基因的轉錄, 如細胞因子、 黏附分子、 趨化因子等[3]； 另一方面,它可活化NLRP3 炎性體, 激活caspase-1, 后者將無活性的pro-IL-1β （31 kD） 剪切成有活性 的IL-1β 成熟體 （17 kD）[15]； IL-1β 被分泌到細胞外后, 可與眾多炎性細胞表面的IL-1R 結合, 導致NF-κB 激活, 最終誘導與放大尿酸鹽激發的炎癥信號。

本實驗表明, 尿酸鹽刺激后巨噬細胞培養液中有大量IL-1β, 提示它誘導了巨噬細胞IL-1β 基因轉錄表達； 預先給予豨桐丸處理后, 其培養液中IL-1β 水平明顯減少, 提示該制劑顯著抑制了尿酸鹽誘導巨噬細胞中IL-1β 基因的轉錄表達。 進一步發現, 尿酸鹽刺激可導致巨噬細胞中IκB表達明顯減少, 表明尿酸鹽誘導了巨噬細胞中其蛋白泛素化降解。 靜息狀態下, IκB 與NF-κB （p65/p50 二聚體） 相結合, 抑制了后者活化, 一旦IκB 降解, 則使p65 發生核轉移而啟動促炎基因的轉錄表達。 本實驗發現預先給予豨桐丸處理后再用尿酸鹽刺激時, RAW264.7 細胞核中p65表達及p65 與DNA 結合活性均明顯降低, 表明該制劑可抑制了尿酸鹽誘導的p65 核轉移及轉錄活性。

綜上所述, 豨桐丸可降低尿酸鹽刺激的巨噬細胞表達IL-1β, 其機制可能與抑制NF-κB 活化密切相關, 以期為該制劑臨床治療痛風提供參考, 為研發相關新藥提供依據。