克癀膠囊對非酒精性脂肪肝大鼠的影響

周艾強， 關衛兵， 王鳳林， 李 理*， 紀翠芳， 楊宏志， 謝英華， 章明敏

（1. 廣州市花都區人民醫院， 廣東 廣州510800； 2. 中山大學附屬第三醫院， 廣東 廣州510630；3. ?？谑腥嗣襻t院， 海南 海口570208； 4. 深圳同安藥業有限公司， 廣東 深圳518000）

近年來隨著生活水平提高、 飲食結構改變, 非酒精性脂肪肝發病率迅速增加, 而且發病年齡日趨年輕化, 其中我國為6.3% ～27.0%[1], 已超過病毒性肝炎成為第1 大肝病[2], 嚴重危害了人民健康。 脂肪肝是一種由多種病因引起的肝臟脂質超過肝濕重3%, 或組織學上30% 以上肝細胞脂肪變性的病理狀態[3], 治療方法除了提倡平衡飲食、適量運動外, 目前臨床上采用調脂、 抗氧化, 但效果不理想； 中藥因其多靶點、 多途徑的特色, 在防治脂肪肝方面取得了顯著療效[4-5]。

克癀膠囊由三七、 黃連、 黃芩、 黃柏、 大黃、 人工牛黃、 人工麝香等組成, 并經紅曲發酵制備, 具有清熱解毒、化瘀散結的功效, 臨床用于濕熱毒邪內蘊、 瘀血阻絡證及急慢性肝炎[6], 對非酒精性脂肪肝具有一定療效。 為進一步了驗證克癀膠囊藥理作用, 本實驗探討該制劑對非酒精性脂肪肝大鼠的影響。

1 材料

1.1 試藥 克癀膠囊（深圳市同安藥業有限公司, 批號171003、 180103）； 水飛薊賓膠囊（陽性對照藥1, 天津天士力圣特制藥有限公司, 批號750604050、 750603024）； 多烯磷脂酰膽堿膠囊[陽性對照藥2, 賽諾菲（北京） 制藥有限公司, 批號7BJD031B、 7BJD039B], 實驗時均以純化水配至所需濃度的混懸液。 總膽固醇 （TCH） （批號MS8115）、 甘油三酯（TG） （批號MS8233）、 高密度脂蛋白膽固醇（HDL） （批號MS8247）、 低密度脂蛋白膽固醇（LDL） （批號MS8327） 檢測試劑盒（寧波美康生物科技有限公司）。 丙二醇、 丙酮（廣州化學試劑廠）； 吐溫80（天津市大茂化學試劑廠）； 膽固醇（河南一品食化有限公司）； 豬膽鹽 （廣東環凱微生物科技有限公司, 批號3206086）； 蛋黃粉、 純化水（自制）。

1.2 儀器 UW620H、 TW423L 電子天平 （日本島津公司）； GL224-1SCN 電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]； MP12001 電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）； BCD-290 W 普通冰箱（青島海爾股份有限公司）； T18 勻漿機（德國IKA 公司）； Dimension Xpand Plus西門子全自動生化分析儀（德國西門子公司）； Excelsior AS 自動組織脫水機、 GEMINI AS 全自動染色機、 HM340E轉輪式切片機 （美國Thermo 公司）； KD-BM Ⅱ包埋機、KD-PI 電腦生物組織攤片機、 KD-H 烘片機（烤片機） （浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）； QCT-1800 病理取材臺（蘇凈安泰空氣技術有限公司）； Axio Lab. A1 顯微鏡（德國ZEISS 公司）； BM-30 生物顯微鏡（上海光學儀器六廠）； DGX-9073B 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海南榮實驗室設備有限公司）； SONY DSC-RX100 數碼照相機[索尼數字產品（無錫） 有限公司]。

1.3 動物 SPF 級SD 大鼠80 只, 雄性, 體質量153.6 ～184.3 g, 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供； 實驗動物質量合格證號43004700039669, 實驗動物生產許可證號SCXK （湘） 2016-0002。 大鼠接收后進行檢疫及適應性觀察, 每天1 次, 連續3～4 d, 包括一般精神狀態、 皮毛、活動情況等, 觀察無異常后開始實驗。

2 方法

2.1 高脂飼料、 乳劑制備 高脂飼料由10%豬油+10%蛋黃粉+1%膽固醇+5%蔗糖+0.2%膽鹽+73.8%基礎飼料組成,高脂乳劑由20 g 花生油+20 g 豬油+15 g 膽固醇+3 g 豬膽鹽+5 mL 吐溫-80+5 mL 丙二醇+蒸餾水適量, 定容至100 mL。造模開始1 ～4 周高脂乳劑灌胃, 劑量按2.5、 5、 7.5、10 mL/kg每周遞增, 造模第5、 6 周為10 mL/kg, 每天1 次。

2.2 給藥劑量配制 克癀膠囊給藥劑量配制方法見表1,水飛薊賓膠囊、 多烯磷脂酰膽堿膠囊給藥劑量分別為35 mg/kg、 0.14 g/kg （均為成人劑量的1 倍）。

表1 克癀膠囊給藥劑量配制方法

2.3 模型建立 80 只大鼠取10 只作為陰性對照組, 給予SPF 大鼠生長繁殖飼料加純化水灌胃； 其余70 只給予高脂飼料喂養6 周, 并且每天灌胃高脂乳劑1 次, 第1～4 周劑量按2.5、 5、 7.5、 10 mL/kg 每 周 遞 增, 第5 ～6 周 為10 mL/kg, 建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。 造模期間, 因灌胃操作失誤死亡10 只大鼠, 因體質量不合格淘汰6 只造模大鼠, 其余造模成功大鼠按體質量區間法隨機分為6 組,每組9 只, 分別為模型組、 水飛薊賓膠囊組、 多烯磷脂酰膽堿膠囊組及克癀膠囊高、 中、 低劑量組（1.51、 0.76、0.38 g/kg）。 另外, 陰性對照組大鼠因體質量不合格淘汰1 只。

造模后, 陰性對照組、 模型組大鼠給予純化水, 其余各組大鼠每天灌胃給予相應藥物1 mL/100 g, 連續14 d,每天1 次, 給藥期間所有大鼠給予SPF 大鼠生長繁殖飼料和正常飲水。 各組給藥方案見表2。

表2 各組給藥方案（n=9）

2.4 指標檢測

2.4.1 體質量、 一般狀況 實驗期間, 每天觀察大鼠狀態； 造模期間, 每周測量大鼠體質量1 次； 給藥時, 每3 d測量大鼠體質量1 次。

2.4.2 肝組織、 血清生化指標 末次給藥后, 大鼠禁食不禁水16 h, 第2 天腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉, 腹主動脈取血 5 mL, 采血后靜置 30 min,3 000 r/min離心10 min, 收集血清, 檢測TCH、 TG、 HDL、LDL 水平。 再稱取肝組織0.2 g, 加入9 倍量乙醇-丙酮（1 ∶1） 制成100 g/L 肝勻漿, 3 000 r/min 離心10 min, 取上清液, 檢測TCH、 TG 水平。

2.4.3 肝指數 取大鼠肝臟, 稱定濕重, 計算肝指數=（肝臟濕重/體質量） ×100%。

2.4.4 肝組織病理變化 切取大鼠肝右葉組織, 置于10%中性福爾馬林中固定, 常規石蠟包埋, 切片, HE 染色, 進行病理分析。 檢查標準[7]見表3。

表3 大鼠肝組織病理變化檢查標準

2.5 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理, 數據以） 表示, 多組間比較采用單因素方差分析； 組間均數兩兩比較時, 方差齊采用LSD 法, 方差不齊采用Dunnett’s T3 法, α=0.05 或0.01。 P＜0.05 差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般狀況 大鼠毛發整潔光澤, 行動靈活, 飲食飲水正常, 排泄物正常, 未見異常。

3.2 大鼠肝指數 表4 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組大鼠肝指數顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊中劑量組大鼠肝指數顯著降低（P＜0.01）。

表4 各組大鼠肝指數比較， n=9）

表4 各組大鼠肝指數比較， n=9）

注：與陰性對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2265_1194_2315.png陰性對照組 2.550±0.069模型組 3.312±0.160**克癀膠囊高劑量組 3.252±0.352克癀膠囊中劑量組 2.997±0.261▲▲克癀膠囊低劑量組 3.140±0.274水飛薊賓膠囊組 3.000±0.251▲▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 2.988±0.103▲▲

3.3 大鼠肝組織指標 表5 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組TCH、 TG 水平顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較,克癀膠囊中劑量組TCH 水平顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血脂指標比較 n=9）

表5 各組大鼠血脂指標比較 n=9）

注：與陰性對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,▲P＜0.05

images/BZ_220_1284_1849_2242_1899.png陰性對照組 1.140±0.137 0.817±0.143模型組 1.621±0.122** 1.103±0.127**克癀膠囊高劑量組 1.515±0.102 1.223±0.290克癀膠囊中劑量組 1.447±0.177▲ 1.041±0.222克癀膠囊低劑量組 1.539±0.099 1.087±0.188水飛薊賓膠囊組 1.568±0.078 1.168±0.181多烯磷脂酰膽堿膠囊組 1.498±0.183 1.090±0.182

3.4 大鼠血清指標 表6 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組TCH、 LDL 水平顯著升高（P＜0.05, P＜0.01）, HDL 水平顯著降低（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊高、 中劑量組TCH 水平顯著降低（P＜0.01）, 各劑量組LDL 水平顯著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

表6 各組大鼠血清指標比較（±s， n=9）

表6 各組大鼠血清指標比較（±s， n=9）

注：與陰性對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2745_2244_2795.png陰性對照組 1.694±0.203 0.598±0.193 0.592±0.075 0.387±0.042模型組 2.048±0.322* 0.571±0.178 0.476±0.103** 0.554±0.093**克癀膠囊高劑量組 1.609±0.323▲▲ 0.745±0.271 0.447±0.075 0.422±0.094▲▲克癀膠囊中劑量組 1.603±0.091▲▲ 0.622±0.203 0.460±0.053 0.421±0.046▲▲克癀膠囊低劑量組 1.801±0.319 0.722±0.205 0.504±0.067 0.461±0.092▲水飛薊賓膠囊組 1.647±0.242▲▲ 0.668±0.165 0.476±0.047 0.436±0.086▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 1.776±0.267 0.606±0.100 0.469±0.058 0.497±0.092

3.5 大鼠肝組織病理變化 圖1 顯示, 陰性對照組大鼠肝細胞未見明顯脂肪變性（＜5%）； 模型組大鼠可見較明顯的肝細胞脂肪變性（＞50%）, 肝小葉內點狀壞死、 少量炎細胞浸潤； 克癀膠囊組、 水飛薊賓膠囊組、 多烯磷脂酰膽堿膠囊組組大鼠肝細胞脂肪變性程度較模型組有不同程度減輕, 小葉內可見點狀壞死灶。 分級匯總見表7。

圖1 各組大鼠肝組織病理變化（HE， ×100）

表7 大鼠肝組織病理變化分級匯總（n=9）

表8 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組大鼠肝臟病理學診斷評分顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊中劑量組評分顯著降低（P＜0.05）。

表8 大鼠肝臟病理學診斷評分s， n=9）

表8 大鼠肝臟病理學診斷評分s， n=9）

注：與陰性對照組比較,** P ＜0.01；與模型組比較,▲P ＜0.05,▲▲P＜0.01

陰性對照組 0.22±0.44模型組 4.44±0.73**克癀膠囊高劑量組 3.89±1.27克癀膠囊中劑量組 3.33±1.00▲克癀膠囊低劑量組 3.44±1.01水飛薊賓膠囊組 2.33±1.50▲▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 3.56±1.24

4 討論

本實驗設計了克癀膠囊低、 中、 高3 個劑量組, 分別相當于成人臨床等效劑量的0.5、 1、 2 倍, 發現1 倍劑量時療效最佳； 2 倍劑量療效低于1 倍劑量, 但優于0.5 倍劑量, 可能與給藥濃度過高有關, 導致藥物未經大鼠胃腸道充分吸收即排出體外, 不能充分發揮作用。 劑量對療效發揮有著重要影響, 本實驗發現克癀膠囊治療非酒精性脂肪肝時存在最佳服用劑量, 超過一定劑量后療效與其不呈正比關系, 這對進一步指導臨床用藥, 把握其最佳治療窗閾具有重要指導意義。 同時, 最佳劑量給藥方案經濟成本效益最高, 有利于減少醫療資源浪費, 為臨床合理用藥提供依據。

中醫將非酒精性脂肪肝歸于“肝癖” “脅痛” “積聚”“痰證” “瘀證” 等范疇, 認為痰、 濕、 濁、 瘀、 熱為其主要病理因素[8]。 克癀膠囊藥性和緩不傷正, 是治療濕熱毒邪內蘊、 瘀血阻絡證、 急慢性肝炎等疾病的傳統中藥, 方中三七活血化瘀, 消腫定痛, 具有降血脂、 降血糖、 清除自由基、 抗炎、 抗氧化[9]等藥理作用, 其活性成分三七皂苷有著改善血液循環、 增加機體免疫力、 抗炎、 抗衰老、護肝等多種生理活性[10-11], 可提高肝組織及血清超氧化物歧化酶（SOD） 水平, 減少肝糖原消耗, 改善肝微循環,減輕線粒體、 內質網等細胞器損傷及肝纖維化[12]； 黃連具有抑制肝臟細胞內脂質的合成等作用, 可減少肝臟對脂質的儲存[13-14]； 黃芩具有降低血脂、 肝脂質水平、 增強機體抗氧化能力[15]； 紅曲是以大米為原料, 經紅曲霉發酵而成的一種紫紅色米曲, 其所含洛伐他汀可抑制體內膽固醇合成, 具有顯著的降血脂功能[16], 各組分具有保肝降脂的協同作用, 可能是中藥復方多成分、 多靶點協同增效的機理。目前臨床治療非酒精性脂肪肝的藥物, 如貝特、 他汀類等在降脂的同時存在一定肝毒性[17], 這與臨床上保肝降脂的目的存在矛盾, 故克癀膠囊這一傳統保肝降脂中藥顯示了優勢。

綜上所述, 克癀膠囊能顯著降低非酒精性脂肪肝大鼠血清TC、 LDL 水平, 明顯緩解肝細胞脂肪變性, 減輕肝臟質量, 降低肝指數, 保護肝功能, 表現出良好的防治作用,可為該制劑臨床應用提供實驗依據。