基于網絡藥理學研究左金丸治療高血壓的分子機制

王 君， 陳奕瑋， 趙 坤， 趙光耀， 蔣文雯

（貴州大學， 貴州 貴陽550000）

高血壓作為一種最常見的慢性疾病, 常伴有頭暈、 頭痛、 頸項板緊、 疲勞、 心悸等癥狀, 隨著人口老齡化加劇,其發病率每年都呈持續增長的狀態, 給患者、 家庭、 社會造成了嚴重的負擔。 左金丸出自朱丹溪名方, 由黃連、 吳茱萸以6 ∶1 比例配伍而成, 方中吳茱萸性溫, 入肝、 腎、脾、 胃經, 上可溫胃散寒, 下可溫暖肝腎, 又能降逆止嘔；黃連性寒, 歸心、 脾、 胃、 肝、 膽、 大腸經, 清熱燥濕,邪火解毒, 具有抗腫瘤、 降壓降脂等活性。 臨床研究證實,左金丸降壓作用比尼莫地平緩慢、 持久、 平穩, 療效確切[1], 但其分子作用機制尚未闡明。

中藥復方具有多成分-多靶點-多途徑的特點, 現有研究手段難以有效說明其作用機制。 網絡藥理學是隨基因組學、 蛋白組學、 系統生物學發展應運而生的, 通過網絡拓撲分析來觀察藥物對病理網絡的干預與影響, 揭示多分子藥物協同作用于人體的奧秘, 這與中醫學從整體角度去診治疾病的理論, 以及中藥及其復方多成分、 多途徑、 多靶點協同作用的原理殊途同歸, 無疑為跨越中西醫間的鴻溝架起了橋梁[2], 也為中醫藥現代化和國際化指明了方向。本研究通過網絡藥理學研究左金丸潛在活性成分、 關鍵靶點、 主要通路, 為揭示該制劑治療高血壓的科學內涵提供了參考。

1 方法

1.1 活性成分虛擬篩選與ADME 分析 通過查閱大量文獻, 收集左金丸已報道的所有活性成分, 同時依托中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP 收集中吳茱萸、 黃連主要活性成分。 該數據庫給每個化合物提供了詳細的吸收、分布、 代謝、 排泄（ADME） 參數, 可通過限制口服吸收利用度（OB）、 藥物相似性 （DL）、 Caco-2 細胞滲透性（Caco-2）、 血腦屏障（BBB）、 半衰期（HL） 等參數, 虛擬篩選活性成分。

1.2 活性成分靶點預測 利用TCMSP 數據庫、 STITCH 數據庫（http： / /stitch. embl. de/）、 SwissTarget 數據庫（http： / /www. swisstargetprediction. ch/） 預測活性成分的作用靶點, 并剔除重復靶點。 靶點相應基因通過檢索Uniprot中的Uniprot KB 數 據 庫Uniprot （http： / /www. uniprot.org/）, 檢索方式為“organism： ‘homo sapiens’ AND reviewed： yes”, 將檢索結果以Excel 格式導出, 即得Uniprot數據庫中人類相關靶蛋白及其對應基因[3]。

1.3 活性成分-靶點網絡構建 將活性成分及其對應的靶點輸 入 Cytoscape 3.6.0 軟 件 （http： / /www. cytoscape.org/）, 構建兩者網絡。

1.4 高血壓靶點篩選 在OMIM 數據庫（http： / /omim.org/）、 PharmGkb （https： / /www. pharmgkb. org/）、 TTD（http： / /bidd. Nus. edu. sg/group/cjttd/）、 DrugBank （http： / /www. drugbank. ca/）、 GAD 數據庫（http： / /geneticassociationdb. nih. gov/） 中輸入關鍵詞Hypertension, 搜索與高血壓相關疾病靶點, 并去除重復基因[4], 即得。

1.5 藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡構建 根據“1.3” “1.4” 項下結果, 應用Cytoscape 3.6.0 中的關聯（Merge） 功能, 將2 個結果合并成藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡圖, 成分靶點圖和疾病靶點圖交集部分即治療高血壓的關鍵靶點, 再通過NetworkAnalyzer 工具計算網絡拓撲參數。 Degree 是指一個節點與其他節點相連的數目,本研究分析Degree≥5 的活性成分。

1.6 靶點類型歸屬 DisGeNET （http： / /www. disgenet.org/web/DisGeNET/menu） 是1 個包含與人類疾病相關的基因和變異的數據庫。 選擇靶點檢索后, 依次輸入關鍵靶點,得到靶點類型相關信息[5]。

1.7 蛋白相互作用網絡構建與分析 String 數據庫（https： / /string-db. org/） 是一種包含已知和預測蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫, 收集了大量蛋白相互作用關系, 共涉及9 643 763 個蛋白, 1 380 838 440 個相互作用, 包括實驗檢測、 生物信息學方法預測得到的數據。 將上述關鍵靶點導入String 數據庫, 限定物種為人, 最低相互作用閥值設為中等置信度0.4 “medium confidence”, 其余參數保持默認設置, 獲取蛋白相互作用關系。 圖中節點之間連線越粗, 表明關聯度越大。

1.8 GO 生物過程、 KEGG 通路富集分析 在DAVID 6.8數據庫（https： / /david. ncifcrf. gov/） 基因列表中輸入關鍵靶點的基因名, 在基因標識符欄中選擇“official-genesymbol”, DAVID 平臺列表與背景均設置為“Homo sapiens”（人類）, 分析工具選擇“functional annotation tool”。 根據P＜0.01、 靶點數量（Count） ≥3 篩選出GO 生物過程和KEGG 通路。

2 結果

2.1 活性成分及ADME 參數 共搜集到224 種成分, 其中吳茱萸176 種, 黃連48 種, 再對其ADME 參數進行篩選,條件為OB≥30%, DL≥0.18, Caco-2≥-0.4, 發現25 種（其中小檗堿是吳茱萸、 黃連共有的成分） 符合條件, 作為候選化合物。 但查閱文獻發現, 目前研究的黃連-吳茱萸藥對主要功效物質基礎也包括檸檬苦素、 藥根堿、 非洲防己堿[6], 故也將三者納入候選化合物。 見表1。

2.2 活性成分靶點 共得到80 個活性成分靶點, 并將其輸入UniProt 數據庫, 轉換成對應的基因名稱。

2.3 活性成分-靶點網絡 共有108 個節點, 406 條邊, 見圖1。

2.4 高血壓靶點 分別在OMIM 數據庫、 PharmGkb、TTD、 DrugBank、 GAD 中發現35、 120、 59、 1、 12 個高血壓潛在作用靶點, 剔除重復靶點后得到210 個。

2.5 藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡 共有47 個節點,154 條邊, 見圖2。 Degree≥6 的活性成分有（R） -四氫小檗堿（Degree = 11）、 1-甲 基-2-壬 基-4-喹 諾 酮 （Degree =11）、 吳茱萸酰胺甲（Degree=10）、 β-谷甾醇（Degree=9）、 氧化小檗堿（Degree=7）、 小檗堿（Degree=6）、 吳茱萸堿（Degree=6） 等, 度值越大, 表明左金丸通過該成分治療高血壓的可能性越大, 見表2。

表1 左金丸中活性成分及ADME 參數

圖1 左金丸活性成分-靶點網絡

2.6 關鍵靶點類型 將圖2 中18 個關鍵靶點輸入DisGeNET 數據庫中, 得到靶點類型相關信息, 見表3, 可知受體最多（10 個）, 其次是氧化還原酶（3 個）、 轉移酶（1個）、 轉錄因子（1 個）、 水解酶（1 個）、 分子伴侶（1 個）。

2.7 蛋白相互作用網絡 String 數據庫構建的蛋白相互作用網絡中包含16 個靶蛋白節點（PDE3A、 NR3C2 未參與蛋白互作）, 共有20 條相互作用連線, 其中度值較大的有Degree=5 的α-1B 腎上腺素能受體（ADRA1B）、 Degree=4的毒蕈堿乙酰膽堿受體M5 （CHRM5）、 Degree=4 的5-羥色胺2 A 受體（HTR2A）、 Degree=4 的α-1D 腎上腺素能受體（ADRA1D）、 Degree = 4 的α-1 A 腎 上 腺 素 能 受 體（ADRA1A） 靶蛋白, 均與其他蛋白相互作用較強。 見圖3。

圖2 左金丸藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡

表2 左金丸藥材-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡拓撲分析

表3 左金丸關鍵靶點類型

2.8 GO 生物過程、 KEGG 通路富集分析 將圖2 中18 個關鍵靶標輸入DAVID 6.8 數據庫, 根據P＜0.01 且靶點數量≥3 篩選出16 個GO 生物過程、 7 條KEGG 通路。 左金丸治療高血壓的作用機制可能與腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、 血管收縮的正調節、 細胞-細胞信號傳導、 平滑肌收縮的正調節、 去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動脈血壓的調節等生物過程相關, 見表4。 另外, 關鍵靶標顯著富集于環鳥苷酸-蛋白激酶G 信號通路（cGMP-PKG 信號通路）、 鈣信號通路、 神經活性配體-受體相互作用、 唾液分泌、 心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、調節脂肪細胞中的脂肪分解、 血管內皮生長因子信號通路（VEGF 信號通路） 等, 見表5。

表4 左金丸GO 生物過程分析

表5 左金丸KEGG 通路富集分析

圖3 左金丸蛋白相互作用網絡

3 討論

左金丸以黃連為主, 佐以吳茱萸, 兩者比例為6 ∶1,其藥理研究方向主要集中在抗癌、 抗潰瘍、 對胃腸功能的影響、 不同配伍比例對藥效的影響等, 近年來研究顯示它還有降血壓的功能, 但具體機制不清楚。 本研究通過網絡藥理學研究左金丸治療高血壓的分子機制, 從藥材-疾病-關鍵靶點-疾病網絡中發現, （R） -四氫小檗堿、 1-甲基-2-壬基-4-喹諾酮、 吳茱萸酰胺甲、 β-谷甾醇、 氧化小檗堿、小檗堿、 吳茱萸堿的Degree 遠高于其他成分, 表明它們可能是降壓的主要藥效基礎, 其中（R） -四氫小檗堿屬于四氫異喹啉類生物堿, 具有抗高血壓、 抗心律失常、 抗纖維性顫動、 抗急性心肌梗死、 防治缺血再灌注損傷作用[7]；1-甲基-2-壬基-4-喹諾酮屬于喹諾酮類生物堿, 是影響血壓的重要成分, 在1 ～100 μmol/L 范圍內均可不同程度地抑制去甲腎上腺素和高鉀引起的血管收縮, 并可通過血管α1受體、 鈣離子通道2 個途徑達到血管擴張、 舒張平滑肌的作用[8-9]； 吳茱萸酰胺甲屬于吲哚類生物堿, 目前對其藥理活性的研究較少, 可能與其他成分協同作用來降低高血壓；肖志彬等[10]報道, β-谷甾醇具有抗炎、 抑制腫瘤、 免疫調節、 抗高血脂、 鎮痛、 促進傷口愈合等廣泛藥理活性, 炎癥介導血管損傷是血壓升高的病理基礎, 而該成分可能正是通過減少炎癥反應來發揮降壓作用； 吳茱萸堿作為吳茱萸主要有效成分, 口服生物利用度最高（86.02%）, 能較好地被胃腸道吸收, 還具有鎮痛消炎、 調節體溫、 調節免疫系統、 減肥等作用[11]； 小檗堿為黃連主要有效成分, 屬異喹啉類生物堿, 其心血管藥理作用包括降低血壓、 抗心律失常、 調節脂代謝、 抗動脈粥樣硬化、 改善頑固性心衰等[12], 以上報道與本研究結果相互印證, 表明網絡藥理學的研究左金丸治療高血壓的分子機制具有科學性。

靶蛋白 ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D、 CHRM5、HTR2A 在蛋白相互作用網絡中的Degree 值較高, 表明左金丸可能通過以上靶點達到降壓療效。 叢科等[13-14]報道,ADRA1A、 ADRA1B、 ADRA1D 是α1 型腎上腺素能受體的3 種亞型, 在交感神經傳遞, 肝臟代謝的調節, 血管張力的控制, 心臟收縮過程中發揮了重要作用； CHRM5 為膽堿能受體, 被激活后會導致多巴胺釋放[15]； 程茹等[16-17]發現, 血管內皮受損后血小板活化, 并釋放5-羥色胺等血管活性物質, 其中5-羥色胺作用于血小板表面的5-羥色胺2 A 受體, 促進血小板聚集活化及血栓形成, 由于高血壓患者易形成血栓, 故左金丸調控HTR2A 時可間接影響高血壓病程。

靶點類型歸屬和GO 生物過程分析顯示, 左金丸治療高血壓涉及受體、 氧化還原酶、 轉移酶、 轉錄因子、 水解酶、 分子伴侶等多種物質, 與腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、 細胞-細胞信號傳導、 平滑肌收縮、 去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮等生物過程相關。 KEGG 通路富集結果表明, 左金丸關鍵靶點基因富集在與高血壓密切相關的信號通路上, 如cGMP-PKG 信號通路、 鈣信號通路、 神經活性配體-受體相互作用、 唾液分泌、 心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、 調節脂肪細胞中的脂肪分解、VEGF 信號通路等通路。 王曉華等[18]報道, 大多數組織中cGMP-PKG 信號通路可調節血管平滑肌細胞收縮和舒張,抗高血壓。 抗心肌肥大, 抗動脈粥樣硬化, 抗血管損傷/再狹窄。 另外, 鈣離子信號通路控制新陳代謝、 分泌、 平滑肌收縮、 增殖等多種過程[19], 左金丸可能通過調節平滑肌收縮來發揮藥效, 與GO 生物過程中平滑肌的收縮相佐證。

神經活性配體-受體相互作用通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合, 調節生理節律、內分泌、 情緒、 學習、 記憶等, 而內分泌失調是引起高血壓的常見原因[20]。 左金丸可通過唾液分泌來間接調控高血壓, 它是維持口腔正常生理功能所必需的, 腺泡上皮細胞內的Ca2+濃度對其造成影響[21], 同時Ca2+也參與鈣信號通路, 再次表明各通路復雜交互, 協同發揮作用。 趙璐等[22]調查研究發現, 不良生活方式導致的肥胖是高血壓發病的重要因素, 而脂肪分解有利于達到降壓效果； 陳明等[23]報道, VEGF 信號通路與高血壓發生有著直接關系, 當高血壓患者內皮功能受損后血壓明顯增高, 上述結果與本研究基本一致, 表明不同信號通路之間存在一定聯系, 共同調節人體機能, 體現了中藥多成分-多靶點-多途徑的作用特點。

綜上所述, 本研究從網絡藥理學角度揭示了左金丸治療高血壓的可能分子機制, 為該制劑進一步藥效物質基礎分析和機制考察提供了依據, 同時也使后續研究更有針對性。