miRNA-29a- 3 p通過靶向PROM 1在喉癌細(xì)胞增殖中的作用研究

張東軍，吳文斌#，涂玲麗，劉志國，杜景云

宜都市中醫(yī)醫(yī)院1耳鼻喉科，2腫瘤科，3病理科，湖北 宜都443300

喉癌是頭頸部腫瘤中一種常見的腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率，是惡性程度最高的腫瘤之一[1-2]。喉癌的病死率在醫(yī)療系統(tǒng)發(fā)達(dá)的國家中逐年下降，但在發(fā)展中國家仍然較高[3]。此外，喉癌引起的一系列并發(fā)癥包括呼吸困難、咳嗽、吞咽困難等問題嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量及疾病預(yù)后[4]，而且分級較高的喉癌患者的診斷和治療仍存在較多的臨床難題[1,5-7]。因此，闡明喉癌的分子發(fā)病機(jī)制對于尋找新的治療策略非常重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，長度為20～23個(gè)核苷酸[8]，通過特異性結(jié)合或切割信使RNA（messenger RNA，mRNA）或抑制其翻譯發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的重要作用[9]。針對喉癌基因組的了解有助于找到新的治療靶點(diǎn)并了解該疾病的分子病理學(xué)。在人喉癌研究中，已有報(bào)道多種miRNA在疾病進(jìn)展過程中的異常表達(dá)[5,10-12]。有研究表明，miRNA-29a-3p在胃癌中可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[13]，但其在喉癌中的作用尚不清楚。本研究通過檢測喉癌組織和細(xì)胞系中miRNA-29a-3p的表達(dá)情況及其對喉癌細(xì)胞系增殖和凋亡的影響，證實(shí)miRNA-29a-3p在喉癌中的作用。另外，在前期工作中，通過數(shù)據(jù)庫篩查發(fā)現(xiàn)prominin 1（PROM1）可能是miRNA-29a-3p的潛在靶基因。因此在本研究中將進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析并驗(yàn)證miRNA-29a-3p與PROM1的靶向作用，從而為喉癌的診斷治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

正常的鼻咽上皮細(xì)胞系NP69以及喉癌細(xì)胞系TU212、M4E、M2E和HEP-2均購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。喉癌細(xì)胞系在低糖的DMEM培養(yǎng)基（購自美國Invitrogen公司）中培養(yǎng)，補(bǔ)充含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購自美國Hy-Clone公司）和1%青霉素/鏈霉素（購自美國Invitrogen公司）；正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69在含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所有細(xì)胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）檢測miRNA-29a- 3 p表達(dá)情況

使用Trizol試劑（購自美國Invitrogen公司）按照說明書從細(xì)胞中提取總RNA。之后，取出2 μg RNA并用DNA酶處理，去除污染的DNA，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Promega公司）將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用RNASYBR?PCR Kit試劑盒（購自日本Toyobo公司）定量檢測miRNA-29a-3p（上游引物：5'-UAAUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'；下游引物：5'-GUUGAGGUGAUGTUGGU-3'）；以U6為內(nèi)參（上游引物：5'-UGACUUCAACAGCGACACCCA-3'；下游引物：5'-CACCCUGUUGCUGUAGCCAAA-3'）。定量反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s、60℃退火延伸30 s、72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCt值，并將所有數(shù)據(jù)根據(jù)內(nèi)參對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較各組miRNA-29a-3p表達(dá)差異。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

①空白對照組（mimic-NC組）：轉(zhuǎn)染mimic-NC質(zhì)粒。②miRNA-29a-3p上調(diào)組（miRNA-29a-3p mimic組）：僅轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒。③miRNA-29a-3p及PROM1的空白對照組（mimic-NC+oe-NC組）：同時(shí)轉(zhuǎn)染mimic-NC質(zhì)粒及oe-NC質(zhì)粒。④僅上調(diào)miRNA-29a-3p而不上調(diào)PROM1組（miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組）：同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒及oe-NC質(zhì)粒。⑤同時(shí)上調(diào)miRNA-29a-3p和PROM1組（miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組）：同時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p mimic質(zhì)粒及oe-PROM1質(zhì)粒。操作方法如下：轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞按2×105/孔接種在6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（購自美國Invitrogen公司）說明書，將終濃度為100 nmol/L的相應(yīng)質(zhì)粒（均購自廣州銳博生物科技有限公司）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h加入20%FBS。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成率

在6孔板中每孔加入2 ml 0.6%底層瓊脂糖（購自美國GIBCO公司），待底層瓊脂糖凝固后，將細(xì)胞均勻懸浮于37℃、0.3%瓊脂糖中，并迅速把2 ml細(xì)胞懸液加到6孔板底層瓊脂糖上（2000/孔），置于4℃10 min。再在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14天，然后在顯微鏡下對形成的克隆計(jì)數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆），計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值。

1.5 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性

采用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細(xì)胞的增殖情況。將細(xì)胞按2×103/孔接種至96孔板中，每組樣本6個(gè)復(fù)孔。分別在24、48、72 h向各孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。溫育后，棄去上清液，向各孔中加入150 μl二甲基亞砜，置于搖床輕微振蕩，直至晶體完全溶解。使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度（optical density，OD）值，比較各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 熒光素酶實(shí)驗(yàn)測定miRNA-29a- 3 p與PROM 1的靶向關(guān)系

為了檢測miRNA-29a-3p對PROM13'-UTR的影響，本研究構(gòu)建了含有部分PROM13'-UTR的熒光素酶表達(dá)載體。PROM1mRNA的野生型片段含有潛在的miRNA-29a-3p結(jié)合位點(diǎn)（UGGUGCU），故使用下述引物：5'-CTGAGTTTCTATTTAGACACTACAACA-3'（正向）和5'-ACAATTTGACATGTGGCATTAACG-3'（反向）進(jìn)行擴(kuò)增。使用KpnI/XhoI限制性內(nèi)切核酸酶將PCR片段插入pGL4 Basic Vector。使用突變試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行PROM13'-UTR的突變，將UGGUGCU結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)锳CCACGA。螢光素酶活性測定，將細(xì)胞用100 ng野生型或突變型PROM1的3'-UTR質(zhì)粒與100 ng miRNA-29a-3p共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，使用熒光素酶測定試劑盒（購自美國Promega公司）測定熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參歸一處理。

1.7 Westernblot法檢測PROM 1及GAPDH蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，細(xì)胞使用RIPA蛋白裂解液進(jìn)行裂解（添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑），收集裂解細(xì)胞至1.5 ml EP管中，利用超聲破碎儀對細(xì)胞進(jìn)行徹底破碎。冰上放置5 min充分裂解后，13 000 r/min、4℃離心20 min，取上清至新的EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣本使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離；使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上；5%脫脂牛奶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-吐溫20緩沖液（trihydroxymethyl aminomethane hydrochloride buffered solution with Tween 20，TBS-T）溶液封閉1 h；按比例稀釋一抗PROM1及內(nèi)參GAPDH并過夜孵育；PBS-T溶液洗膜并室溫下孵育相應(yīng)的二抗1 h；最后充分洗膜完成后，使用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液進(jìn)行曝光成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞中miRNA-29a- 3 p相對表達(dá)量的比較

正常NP69細(xì)胞、TU212細(xì)胞、M4E細(xì)胞、M2E細(xì)胞和HEP-2細(xì)胞的miRNA-29a-3p相對表達(dá)量分別為（2.38±0.07）、（0.31±0.03）、（1.21±0.06）、（1.13±0.07）、（0.55±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=577.121，P＜0.01）；TU212細(xì)胞、M4E細(xì)胞、M2E細(xì)胞和HEP-2細(xì)胞的miRNA-29a-3p相對表達(dá)量均明顯低于正常NP69細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.583、4.672、5.036、6.129，P＜0.01）。除正常NP69細(xì)胞外，選擇相對表達(dá)量最低的TU212細(xì)胞作為受試細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 上調(diào)miRNA-29a- 3 p表達(dá)對PROM 1蛋白表達(dá)情況的影響

Western blot法檢測顯示，miRNA-29a-3p mimic組TU212細(xì)胞PROM1蛋白相對表達(dá)量為（0.448±0.075），明顯低于mimic-NC組的（1.135±0.106），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.964，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot法檢測mimic-NC組和miRNA-29a- 3 p mimic組TU212細(xì)胞中PROM 1蛋白表達(dá)情況

2.3 熒光素酶活性的比較

經(jīng)熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p后，野生型PROM1的熒光素酶活性為（0.627±0.089），明顯低于mimic-NC組的（1.000±0.103），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.750，P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染miRNA-29a-3p后，突變型PROM1的熒光素酶活性為（0.985±0.107），與mimic-NC組的（1.000±0.112）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.274，P＞0.05）。

2.4 miRNA-29a- 3 p調(diào)控PROM 1對喉癌細(xì)胞增殖能力的影響

miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組細(xì)胞克隆形成率低于mimic-NC+oe-NC組和miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；mimic-NC+oe-NC組與miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組細(xì)胞克隆形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2、表1）

miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)OD值均低于mimic-NC+oe-NC組和miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；mimic-NC+oe-NC組與miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組各時(shí)間點(diǎn)OD值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

圖2 各組喉癌細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色，×200）

表1 各組喉癌細(xì)胞增殖情況的比較（± s）

表1 各組喉癌細(xì)胞增殖情況的比較（± s）

注：a與mimic-NC+oe-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組比較，P＜0.05

組別mimic-NC+oe-NC組miRNA-29a-3p mimic+oe-NC組miRNA-29a-3p mimic+oe-PROM1組F值P值克隆形成率（%）0.97±0.072 0.41±0.045a 0.93±0.067b 200.24 0.000 OD值24 h 0.72±0.03 0.46±0.03a 0.79±0.03b 10.360 0.027 48 h 2.14±0.07 1.57±0.08a 2.37±0.07b 16.730 0.018 72 h 2.83±0.11 1.98±0.12a 3.02±0.11b 24.510 0.006

3 討論

在喉癌中發(fā)現(xiàn)了許多miRNA轉(zhuǎn)錄后水平可調(diào)節(jié)基因表達(dá)[14-15]，然而，仍有未知的miRNA。已有的研究中指出了miRNA-29a-3p在某些類型的腫瘤中是腫瘤抑制性miRNA[16]。本研究發(fā)現(xiàn)與正常鼻咽細(xì)胞系相比，miRNA-29a-3p在喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下調(diào)。在喉癌細(xì)胞中上調(diào)miRNA-29a-3p表達(dá)可顯著降低細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞克隆能力。PROM1是一種致癌基因，被證實(shí)是喉癌細(xì)胞中miRNA-29a-3p的直接靶基因。在本研究亦證實(shí)PROM1是miRNA-29a-3p的靶向基因，且在TU212細(xì)胞中上調(diào)PROM1表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)miRNA-29a-3p對喉癌細(xì)胞增殖的抑制作用，證明miRNA-29a-3p通過靶向PROM1抑制喉癌細(xì)胞增殖，這表明miRNA-29a-3p作為腫瘤抑制性miRNA發(fā)揮作用。

大多數(shù)先前的研究表明，miRNA-29a-3p在膠質(zhì)細(xì)胞瘤及肝癌中起著抑制腫瘤的作用[10,17]。miRNA-29-3p包括miRNA-29a-3p、miRNA-29b-3p和miRNA-29c-3p。本研究主要集中在miRNA-29a-3p，因?yàn)槠湓诤戆┲斜磉_(dá)水平較低，而且在喉癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中miRNA-29b-3p和miRNA-29c-3p表達(dá)水平?jīng)]有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，喉癌細(xì)胞中miRNA-29a-3p的表達(dá)下調(diào)。針對miRNA-29a-3p的細(xì)胞功能研究，本研究證實(shí)了miRNA-29a-3p能夠降低喉癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力、克隆形成率。因此，以上數(shù)據(jù)均表明miRNA-29a-3p在喉癌中發(fā)揮著抑制性miRNA的作用。

PROM1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[18]。PROM1是干細(xì)胞以及多種腫瘤的潛在診斷分子標(biāo)志物[19-21]。在本研究中，證實(shí)了PROM1是miRNA-29a-3p的下游靶點(diǎn)，并且也是喉癌細(xì)胞中miRNA-29a-3p的功能介導(dǎo)因子。在PROM1的3'-UTR中存在miRNA-29a-3p的互補(bǔ)序列，本研究通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)正常的PROM13'-UTR會使熒光素酶的活性受到抑制，但miRNA-29a-3p對突變體PROM13'-UTR沒有影響。這表明miRNA-29a-3p可能與PROM13'-UTR結(jié)合，然后促進(jìn)PROM1mRNA的降解并抑制PROM1的翻譯。

綜上所述，miRNA-29a-3p是一種喉癌抑制性的miRNA。miRNA-29a-3p通過調(diào)節(jié)PROM1影響人喉癌的發(fā)生和發(fā)展，可能是治療喉癌的潛在靶點(diǎn)，其在喉癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用可能有助于患者的診斷和預(yù)后。本研究結(jié)果為更好地了解喉癌的發(fā)病機(jī)制及其可能的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。