表面外胚層敲除Mfn2基因對小鼠眼視網膜發育的影響

張帆，張嬌，李函容，嚴肖嘯，趙江月

（中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005）

線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）是介導線粒體融合的蛋白質之一，是調節線粒體運動、呼吸活動等生理活動的關鍵分子。Mfn2基因的缺失有可能會引發mtDNA功能障礙，從而導致線粒體氧化磷酸化功能受到間接影響，從而中斷呼吸鏈，促進更多細胞內活性氧出現，細胞凋亡由此發生。研究［1］發現，表面外胚層Mfn2功能的條件性喪失導致一系列先天性眼缺陷，包括眼球及晶狀體體積減小，晶狀體渾濁和角膜增厚。而眼組織的發育源于神經外胚葉、表皮外胚葉和中胚葉，發育過程復雜，存在各組織間的相互作用，如晶狀體對視網膜發育的誘導［2］。由于這種誘導關系的存在，筆者猜測Mfn2基因對視網膜的發育同樣存在影響。

各種原因引起的視網膜細胞凋亡是視網膜疾病中視覺喪失的根本原因［3］，如視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變和視網膜脫離等。視網膜中色素上皮層以及光感受器細胞層具有高代謝活性，而氧化損傷引起的視網膜代謝功能障礙是導致年齡相關性視網膜疾病中視覺衰退甚至喪失的主要原因［4］。已有研究表明參與線粒體融合和分裂的蛋白也廣泛參與細胞過程，如線粒體代謝、氧化還原信號轉導，維持mtDNA完整性和細胞死亡。因此，對視網膜發育過程中線粒體相關的調控機制進行研究具有重要意義和價值。

本研究觀察了Mfn2基因在小鼠視網膜中的表達情況以及Mfn2對小鼠晶狀體視網膜發育間相互誘導的影響，為今后研究線粒體與視網膜變性疾病的關系提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所有動物實驗均經中國醫科大學倫理委員會（16005M）批準，動物實驗按照《動物使用與護理指南》進行。Le-Cre轉基因小鼠和Mfn2等位基因小鼠由中國醫科大學實驗動物中心提供。所有動物均飼養于SPF環境中，12 h光/暗周期和溫度控制。在Pax6啟動子的控制下表達Le-Cre重組酶的轉基因小鼠與Mfn2轉基因小鼠進行交配，并再次對攜帶Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl基因的雄鼠與Mfn2fl/fl的雌鼠交配，將子代中Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl（Mfn2CKO）和Mfn2fl/fl（Mfn2WT）鼠分別設為實驗組與對照組。

1.2 實驗動物基因型的測定

剪取同窩實驗組及對照組小鼠鼠尾，放入裂解液中裂解并提取DNA，行PCR 擴增，擴增條件為94℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，經歷30個循環，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。配制濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，電泳時間20 min，電壓140 V，待電泳結束后使用凝膠呈像分析系統照相。

1.3 HE染色實驗檢測小鼠眼部形態發育

分別在4 ℃下用4%多聚甲醛固定2組小鼠的胚胎頭或出生后眼，分別用50%、75%、85%、95%和100%乙醇梯度脫水2 h。石蠟包埋，組織切片機4 mm切片。經HE染色后，中性樹脂封片，光學顯微鏡采集圖像。

1.4 免疫熒光方法觀察Mfn2在小鼠視網膜中的定位

將石蠟切片依次置于50 ℃二甲苯（2 次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；PBS清洗3次（5 min/次）；將切片置入加熱至沸騰的pH6.0、0.1 mol/L枸櫞酸抗原修復液中，用微波爐使枸櫞酸液沸騰維持10 min，待其冷卻至室溫；BSA室溫封閉l h；加入兔抗鼠Mfn2一抗（1∶200稀釋），4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次（5 min/次）；滴加山羊抗兔熒光二抗（1∶500 稀釋），室溫下避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI（1 ∶1 000稀釋）復染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

1.5 免疫熒光方法觀察Mfn2基因條件敲除小鼠角膜BrdU標記變化

取E14.5、E17.5、E18.5胎齡小鼠行BrdU腹腔注射（100 mg/kg），1 h后處死，制備石蠟切片。依次置于50 ℃二甲苯（2次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；PBS清洗3次（5 min/次）；加入稀鹽酸37℃孵育30 min；加入0.1 mol/L四硼酸鈉，37 ℃下孵育10 min；PBS清洗3次（5 min/次）；BSA 室溫封閉l h；加入兔抗鼠 Mfn2一抗（1∶200稀釋），4 ℃孵育過夜；37 ℃輕搖后，轉入4 ℃過夜；37 ℃復溫1 h；PBS清洗3次（5 min/次）；滴加山羊抗兔熒光二抗（1∶500 稀釋），室溫下避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI復染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

1.6 TUNEL法檢測小鼠角膜在胚胎期及生后的凋亡情況

將制備好的石蠟切片在60 ℃烤片機上烤片1 h，然后脫蠟水化：依次置于50 ℃二甲苯（2次，5 min/次）、無水乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min、75%乙醇5 min以及50%乙醇5 min；蛋白酶K 37℃消化20 min；1×PBS清洗3次（5 min/次）；5 μL TdT酶+45 μL熒光標記液的混合液中避光孵育l h；PBS清洗3次（5 min/次）；DAPI復染l min；PBS清洗3次（5 min/次）；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

2 結果

2.1 Mfn2基因在視網膜中的表達位置

視網膜在小鼠出生后20 d左右發育成熟。為了探究Mfn2基因在視網膜中的表達位置，本研究選取P20的野生型小鼠進行免疫熒光檢測，結果發現Mfn2基因在成熟視網膜中定位于視網膜光感受器外節。見圖1。

2.2 表面外胚層Mfn2基因條件性敲除導致眼球結構發育異常

取同窩的實驗組與對照組小鼠進行HE染色，結果顯示，在E15.5至E17.5期間，實驗組小鼠的眼球體積較對照組小，視網膜厚度不均勻，局部有增厚現象。至生后18 d時，實驗組小鼠眼球體積較小，視網膜較對照組厚度增加。見圖2。

圖1 Mfn2基因在小鼠成熟視網膜中的表達 ×200Fig.1 Expression of Mfn2 gene in mature retina of mice ×200

2.3 Mfn2 CKO鼠與Mfn2 WT鼠視網膜細胞增殖差異

為了研究Mfn2基因條件性敲除后對視網膜細胞增殖的影響，本研究選取胚胎時期E14.5、E17.5及E18.5的實驗組及對照組鼠進行BrdU實驗。結果顯示，E14.5時，實驗組及對照組小鼠視網膜均有明顯細胞增殖且無顯著差異；E17.5時，實驗組視網膜細胞增殖數較對照組視網膜細胞增殖數明顯減少；E18.5時，2組視網膜細胞增殖數均明顯減少。見圖3。

2.4 Mfn2 CKO鼠與Mfn2 WT鼠視網膜細胞凋亡差異

圖2 Mfn2 CKO小鼠視網膜發育異常 HE染色Fig.2 Abnormal retinal development in Mfn2 CKO mice HE staining

圖3 Mfn2 CKO小鼠視網膜細胞增殖情況變化 ×100Fig.3 Proliferation changes of retinal cells in Mfn2 CKO mice ×100

為了探究實驗組與對照組小鼠視網膜細胞凋亡情況的變化，本研究分別選取E17.5、P5及P20的小鼠進行TUNEL檢測。結果發現，E17.5時實驗組與對照組小鼠視網膜細胞凋亡數（7±1.57，4±1.61）均較少，但P5及P20時，2組小鼠視網膜凋亡細胞數均明顯增加，且實驗組凋亡數多于對照組（P5：實驗組98±2.97，對照組74±2.86；P20：實驗組33±1.57，對照組14±1.81）。見圖4。

圖4 Mfn2 CKO小鼠視網膜細胞凋亡情況變化Fig.4 Apoptosis changes of retinal cells in Mfn2 CKO mice

3 討論

視網膜的發育受多種信號轉導途徑及細胞因子的影響，如Notch信號轉導途徑，hedgehog信號轉導途徑，以及表皮生長因子（epidermal growth factors，EGFs）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGFs）、神經生長因子（nerve growth factors，NGF）等。它們在特定的時空條件下，通過復雜的細胞間相互作用，激活細胞內信號級聯反應，最終引起相關基因（如Pax6，Ras，BMP，Eya，Prox1，Vax，Nogo等）表達，從而影響視網膜的發育、分化和增殖。而影響視網膜發育的某些基因，如Pax6、BMP，也同樣存在于眼部其他組織［5］。

Mfn2是含757個氨基酸、具有三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性的線粒體外膜蛋白，它與Mfn1共同參與線粒體外膜融合［6］。研究［7］表明，線粒體融合和裂變對于細胞存活和凋亡具有重要意義。其中關于細胞凋亡的研究表明，Bcl-2家族成員（Bax，Bak，Bcl-2 和 Bcl-xL）和線粒體形態發生相關蛋白（Mfn1，Mfn2，Drp1和Fis1）有直接關系。本研究采用基于Cre/LoxP系統的條件性基因打靶技術構建表面外胚層Mfn2基因條件性敲除小鼠，通過將特異啟動子控制表達位置的Cre重組酶的轉基因小鼠Le-Cre與Mfn2條件性基因打靶小鼠（Mfn2flox/flox）交配，將子代中Le-Cre+/-；Mfn2fl/fl（Mfn2CKO）和Mfn2fl/fl（Mfn2 WT）小鼠分別作為實驗組與對照組進行研究。結果發現，Mfn2表面外胚層條件性基因敲除小鼠不僅在晶狀體發育中存在嚴重缺陷，且在胚胎期發育中，視網膜各層厚度不均，細胞增殖數減少，細胞凋亡增加。

本研究在表面外胚層條件性敲除Mfn2基因，導致視網膜發育受到影響，其原因涉及眼胚胎發育過程中存在胚胎誘導，即胚胎發育中2種胚胎組織通過相互作用對其中1種或2種組織的形態發生產生影響［8］。Mfn2缺失和線粒體動力學其他組分的潛在下降不僅阻礙線粒體形成，也能造成代謝和氧化還原穩態的惡化，增加應激誘導的突變和凋亡，使視網膜細胞的增殖與凋亡發生改變，同時猜測Mfn2基因的缺失會間接影響與眼發育相關的其他基因的表達，這些基因同時表達于表面外胚層和神經外胚層，通過晶狀體視網膜間的胚胎誘導作用，導致視網膜的發育異常和視網膜細胞的增殖凋亡改變。而視網膜變性疾病是一組由于視網膜感光細胞變性凋亡所導致的嚴重致盲性眼病，動物視網膜變性的發病機制與人類的視網膜變性疾病有某些同源性。研究者普遍認為，視網膜老化及視網膜變性（年齡相關性）的基本因素為氧化應激和視網膜老化［9］。因此，對Mfn2的研究為視網膜的發育以及視網膜變性疾病提供了新的研究靶點。本研究是利用表面外胚層條件性基因敲除小鼠進行視網膜發育的表型觀察，未來將利用神經外胚層條件基因敲除小鼠進一步觀察Mfn2對視網膜發育的直接影響。