Doxycycline誘導表達Msx2-GFP的鼠晶狀體上皮Alpha-TN4細胞株的建立

張嬌，于紫燕，趙江月

（中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005）

肌節同源盒基因同系物2（msh homobox 2，Msx2）作為肌節同源框基因家族的一員，其編碼的轉錄抑制蛋白可調控細胞的存活與凋亡［1］。它多表達在間充質細胞與上皮細胞的交界處以及細胞增殖的區域，在體內控制著細胞的增殖和分化，與心血管、骨骼、眼耳鼻等組織發育密切相關，Msx2的表達異常或突變會對機體產生不良影響［2-3］。

在眼發育學研究領域，國外有研究［4］結果顯示，在Msx2轉基因鼠中發現小眼球畸形及視網膜發育缺陷。先前的研究［5］中也發現Msx2表達異常，通過抑制FoxE3基因并上調Prox1的表達來調控晶狀體的發育。同時，敲除Msx2基因可通過激活Casp3/Casp8凋亡信號通路，引起晶狀體組織中凋亡增加［6］。晶狀體細胞凋亡是導致白內障發生的機制之一，因此，把Msx2作為靶因子導入晶狀體上皮細胞，抑制細胞增殖和分化，觸發凋亡，可能成為基因治療晶狀體及白內障相關疾病的一個突破性進展。

本研究利用基因開關調節系統（Tet-on），擬建立由doxycycline調控表達的Msx2誘導細胞株，探索其差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），為進一步的臨床研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：實驗組選取doxycycline誘導表達Msx2的Alpha-TN4細胞株M8；空載體細胞株T9作為對照。

1.2 細胞培養及誘導

細胞株M8空載體T9在含胎牛血清的細胞培養液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）過夜培養。經doxycycline（1 μg/mL）處理后，24 h后共聚焦熒光顯微鏡觀察，并收集細胞。

1.3 蛋白提取及濃度測定

培養的細胞用預冷的PBS洗3遍，加入適量（200 μL/60 mm皿）裂解液，細胞刮收取蛋白至EP管每次超聲15 s，重復5次，放置30 min，4 ℃離心12 000 r/min，15 min，取上清。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（北京吉美生物有限公司）測定樣本液蛋白濃度。

1.4 二維凝膠電泳

配制CyDye DIGE工作液（400 pmol/μL），根據蛋白定量結果，標本及1份混合內標各取50 μg加入1 μL濃度為400 pmol/μL的CyDye DIGE染料，避光。漩渦震蕩，徹底混合，12 000g4 ℃離心10 min，收集底部標記混合物，在黑暗中冰上反應30 min。加入1 μL 10 mmol/L賴氨酸終止標記反應。充分混合，在黑暗中置于冰上10 min。每份樣品加入同體積的補充液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%DTT、2% IPG Buffer），用再水化液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、18 mmol/L DTT、2% CHAPS、0.5% IPG Buffer）將樣品體積補至340 μL，將18 cm IPG膠條（pH 3～pH 10，NL）置于膠條槽內，上樣后在IPGphor固相pH梯度等電聚焦儀上行等電聚焦。整個過程避光。灌制12%SDS-PAGE膠，脫氧并保證膠面平齊。將IPG膠條置放在兩低熒光玻璃板間的凝膠面上，用0.5%低融點瓊脂糖溶液包埋。恒溫20 ℃，行SDS-PAGE電泳（15 mA/膠，30 min；30 mA/膠，4 h）。整個過程避光，最后行考馬斯亮藍染色。

1.5 掃描及圖像分析

電泳所得凝膠用MilliQ沖洗后用Typhoon 9400熒光掃描儀在不同激發光下掃描成像，所使用波長如 下：Cy2-488/520，Cy3-532/580，Cy5-633/679。所 得的蛋白質組圖譜用DeCyder 2-D凝膠圖像分析軟件進行檢測、自動分析，光斑體積的差異作為實驗組與對照組蛋白表達水平變化的衡量指標，采用Mann WhitneyU-test進行統計學檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立由doxycycline誘導穩定表達Msx2的鼠晶狀體上皮細胞株

經過擴增培養后，G418篩選出明顯由doxycycline調控誘導表達Msx2-GFP的Alpha-TN4細胞株，為M8克隆。同時，以空載體細胞株T9作為陰性對照。細胞株M8在無doxycycline存在的條件下不表達Msx2-GFP，在加入doxycycline（1 μg/mL）10 h后，Msx2-GFP開始有微量表達，隨著時間增加，Msx2-GFP的表達量隨之增高。細胞株M8和T9在doxycycline（1 μg/mL）處理24 h后，以共聚焦顯微鏡檢測可見細胞株M8有Msx2-GFP明顯表達，見圖1。

圖1 Doxycycline處理24 h后誘導細胞株M8及T9 ×100Fig.1 Induction of M8 and T9 cell lines by a 24-h doxycycline treatment ×100

2.2 二維電泳分析M8及T9細胞株蛋白質

由誘導的細胞株M8和空載體T9陰性對照樣品分別獲得二維凝膠電泳圖譜，每組樣品重復3次。經圖像分析分別在實驗組M8檢測到5 460個點，對照組T9檢測到5 389個點。其中M8與T9之間差異點有31個，見圖2。

圖2 二維電泳分析晶狀體上皮細胞蛋白質Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis of lens epithelial cell proteins

2.3 RNA微陣列分析和array結果的分析

對M8及T9 2組細胞進行了基因表達微陣列分析。通過SAS統計軟件篩選DEGs。結果顯示，在Alpha-TN4細胞系中存在712個多于2倍的表達變化的DEGs，其中454個基因被上調，258個基因被下調。在下調的基因中，Col3α1基因下調明顯，見圖3。對2組細胞進行實時PCR分析，檢測到M8組mRNA的相對表達量為7.91±0.35，T9組mRNA的相對表達量為4.08±0.26。Col3α1表達量明顯下降，此結果與上述結論保持一致。

圖3 M8及T9細胞株DEGsFig.3 Differentially expressed genes in M8 and T9 cells

3 討論

Msx2是新近發現的參與調控細胞凋亡的關鍵蛋白。以往研究［7-8］多集中在Msx2對心血管、骨骼等組織發育的影響上，本研究利用基因開關調節系統（Tet-on），首次建立由doxycycline調控表達的Msx2誘導晶狀體上皮細胞株。該系統利用改良的大腸桿菌E.coli的調節系統，靶基因的表達受四環素的衍生物doxycyclin精確調節，故具有低毒性、特異性、高敏感性，且不影響細胞內其他基因活性的特點［9］。在誘導細胞株中，Msx2受doxycycline的精確調節，使誘導細胞株建系成功。Msx2誘導細胞株的建立為研究Msx2功能提供了良好的細胞模型。

本研究采用比較蛋白質組學的理論和方法，對誘導細胞株M8和陰性對照細胞株T9蛋白質組進行分析和比較，檢測差異明顯的蛋白質。經過基因表達微陣列分析，分析出明顯下調及上調的基因。并對其中在Msx2過表達細胞株M8中下調明顯的Col3α1進行實時PCR分析驗證，結果顯示，過表達Msx2基因的晶狀體上皮細胞與正常細胞相比，Col3α1的表達量明顯下降，該結果與基因表達微陣列分析結果保持一致。

Col3α1作為一種Ⅲ型膠原，主要存在于細胞外基質中，尤其在人的血管內膜、肌肉等結締組織中含量豐富［10］。在晶狀體中，膠原纖維的異常增生會加速晶狀體上皮細胞纖維化，加速細胞移行，從而導致晶狀體渾濁。已知后發性白內障（posterior capsular opacification，PCO）的發生與晶狀體囊膜的纖維化和基質的積聚和收縮有關［11］。其中晶狀體囊膜由晶狀體上皮細胞核纖維產生，富含Ⅳ型膠原蛋白，也含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原及細胞外基質成分。研究發現正常情況下Ⅳ型膠原纖維均勻分布于晶狀體囊全層，同時還存在Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅲ型膠原因具有特異性而使晶狀體囊區別于眼球內其他基底膜組織［12-13］。而膠原纖維以及細胞外基質的異常沉積是PCO發生的重要病理機制［14］。本研究中Msx2過表達引起的Col3α1下調可能是晶狀體上皮細胞發生凋亡的一個潛在機制，這一發現為PCO的基因治療提供了新的研究思路。但Msx2與Col3α1之間是否存在直接聯系，以及Col3α1如何影響Msx2，從而促發細胞凋亡，仍需進一步研究。