腹主動(dòng)脈雙夾閉法構(gòu)建大鼠脊髓缺血再灌注損傷的有效性探討

尉 娜 路 坦

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 4530032)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外二科，河南 衛(wèi)輝 453100

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia/reperfusion injury，SCII)是指解除脊髓受壓，血液再通后出現(xiàn)的皮膚麻木、肢體無力等神經(jīng)損傷癥狀，甚至發(fā)生截癱或死亡，其發(fā)生機(jī)制可能是多種因素參與的血液再通后的不可逆性神經(jīng)缺失[1-4]，其截癱發(fā)生率可能是2.9%～40%[5-6]。SCII的特點(diǎn)是不可預(yù)知性、不可逆性及難治性等，因此成為脊髓損傷中較為特殊的一類[7-9]。一旦發(fā)生截癱，SCII患者需要終生康復(fù)護(hù)理，嚴(yán)重影響患者本身的生活質(zhì)量，也給家庭、國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。為深入研究SCII的發(fā)生機(jī)制以及治療方案，建立合理的SCII的動(dòng)物模型是十分重要的，但目前構(gòu)建SCII動(dòng)物模型方法多種多樣[10-12]，探尋理想的合理的動(dòng)物模型一直是研究人員關(guān)注的重點(diǎn)。本研究應(yīng)用腹主動(dòng)脈雙夾閉法進(jìn)行大鼠SCII動(dòng)物模型的構(gòu)建，并通過動(dòng)物行為評(píng)分、HE染色、髓過氧化物酶檢測(cè)以及cleaved-caspased-3蛋白檢測(cè)觀察大鼠SCII的有效性。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，200g左右，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證 SCXK(京)2012-0001)。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：脂氧素A4、cleaved-caspase-3(美國Cayman公司)，白介素1β和腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R&D公司)，髓過氧化物酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，多功能全波長掃描酶標(biāo)儀(美國Thermo Multiskan公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，PVDF轉(zhuǎn)印膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Merck Millipore公司)，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，多功能全波長掃描酶標(biāo)儀(美國 Thermo Multiskan公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 構(gòu)建大鼠SCII動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠均使用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，取腹正中切口，逐層切開，暴露腹主動(dòng)脈及左腎，在左腎動(dòng)脈開口上端水平及左右髂總動(dòng)脈分叉水平的腹主動(dòng)脈處分別使用無創(chuàng)動(dòng)脈夾閉，30min后放開動(dòng)脈夾，血流恢復(fù)后關(guān)腹。時(shí)候分籠飼養(yǎng)，肌注青霉素預(yù)防感染。空白組大鼠只暴露腹主動(dòng)脈，不作夾閉處理。

1．2．2 大鼠SCII動(dòng)物模型的分組及處理：實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為缺血再灌注組與假實(shí)驗(yàn)組，每組16只。缺血再灌注組(SCII組)：制作大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型后30min進(jìn)行脊髓鞘內(nèi)注射10 μL生理鹽水；空白組(Sham組)：大鼠只暴露腹主動(dòng)脈，不作夾閉處理。

1．3評(píng)估動(dòng)物模型有效性

1．3．1 運(yùn)動(dòng)康復(fù)評(píng)估：造模后6 h、12 h、24 h、48 h分別評(píng)價(jià)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)狀況，評(píng)價(jià)方法按照BBB評(píng)分[13]。由兩個(gè)訓(xùn)練有素的人員完成，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件一無所知。實(shí)驗(yàn)要在空曠的環(huán)境中進(jìn)行，由觀察人員分別觀察各只大鼠的活動(dòng)，包括軀干、后肢以及尾巴，并進(jìn)行評(píng)分(0～21分：0分為沒有運(yùn)動(dòng)；21分為正常運(yùn)動(dòng))，每只大鼠取兩個(gè)觀察人員的平均值。

1．3．2 檢測(cè)髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)：2組大鼠分別在術(shù)后6、12、24、48 h后頸椎脫臼法處死，取出腰段脊髓，稱取2組脊髓組織(濕質(zhì)量)100 mg，勻漿后采用鄰聯(lián)二茴香胺法檢測(cè)MPO活性，測(cè)定波長為460 nm(嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作)。

1．3．3 HE染色：實(shí)驗(yàn)大鼠分別于再灌注24h后處死，無菌條件下取出腰段脊髓首先使用4%中性甲醛固定，再應(yīng)用石蠟包埋后切片，隨后行HE染色(切片脫蠟、染色、切片脫水和樹脂封片)放入倒置顯微鏡下觀察各組脊髓組織形態(tài)。

1．3．4 Western blotting檢測(cè)脊髓組織的cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)：實(shí)驗(yàn)大鼠分別于再灌注24h后處死，無菌條件下取出腰段脊髓，加入預(yù)冷的裂解液，充分研磨后13 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中置于冰上待用。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度，將上樣緩沖液放入等量蛋白樣品中，97 ℃加熱6 min變性，室溫冷卻離心后上樣。采用電轉(zhuǎn)儀將蛋白從分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，將PVDF膜放入封閉液(TBST/5%脫脂奶粉)中，室溫封閉0.5 h。加入一抗(用封閉液稀釋)，室溫孵育1 h或4 ℃雜交過夜。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，取等體積混合均勻的ECL中的A、B液，滴在PVDF膜上，孵育1min后暗室顯影。

2 結(jié)果

2．1大鼠運(yùn)動(dòng)康復(fù)評(píng)分SCII組大鼠造模后BBB評(píng)分明顯低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別6h12h24h48hSham組21212121SCII組3.22±0.32#4.38±0.65#4.75±0.82#3.97±0.55#

注：與Sham組各時(shí)間亞組相比，#P<0.05

2．2檢測(cè)髓過氧化物酶活性Sham組各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓的MPO活性較低，均低于SCII組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2．3組織學(xué)形態(tài)Sham組(圖1A)脊髓組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核完整、居中；SCII組(圖1B)脊髓組織中神經(jīng)元細(xì)胞核固縮碎裂，甚至溶解，中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞明顯親潤。

2．4Westernblotting檢測(cè)脊髓組織cleaved-caspase-3的表達(dá)Sham組大鼠脊髓組織中cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于SCII組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

為了探索SCII的發(fā)病機(jī)制及合理的防治方案，常需要更加符合人類功能的動(dòng)物模型，理想的SCII動(dòng)物模型需要滿足以下幾個(gè)條件：(1)與人SCII臨床表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制有緊密相關(guān)性，可以科學(xué)有效地進(jìn)行模擬人體癥狀[14-15]；(2)性價(jià)比高且簡單易行，模型制作可以重復(fù)應(yīng)用；(3)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)符合國際體系。從模型構(gòu)建的動(dòng)物選擇而言，恒河猴等靈長類動(dòng)物的機(jī)體功能與人類更加符合，但性價(jià)比較低，并且不易獲取，因此受到一定局限[16-19]。大鼠繁殖能力強(qiáng)、價(jià)格便宜，因此成為各種疾病構(gòu)建動(dòng)物模型常選的動(dòng)物之一，并且大鼠的脊髓供血與人體相似，因而被認(rèn)為是構(gòu)建SCII動(dòng)物模型的常用動(dòng)物之一[20-21]。大鼠SCII動(dòng)物模型常需要阻斷脊髓供應(yīng)的血管，目前阻斷血流的辦法主要集中在動(dòng)脈夾閉法和氣囊阻斷法兩種[22]。氣囊阻斷法是較為新穎的阻斷血流方法，可以降低動(dòng)脈的損傷[23]，但阻斷血流仍有不完全的可能，因此仍不能替代動(dòng)脈夾閉法成為構(gòu)建SCII動(dòng)物模型的主流方法。而動(dòng)脈夾閉法是經(jīng)典的SCII動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，能夠確切阻斷脊髓供應(yīng)血流，并且符合理想SCII動(dòng)物模型的條件，而且易于重復(fù)[24-26]，仍然是制作SCII動(dòng)物模型的經(jīng)典方法。

表2 2組大鼠脊髓髓過氧化物酶活性

注：與Sham組相比，#P<0.05

圖1 2組大鼠脊髓再灌注24 h后脊髓組織的HE染色(×200)Figure 1 HE staining of spinal cord tissue after spinal cord reperfusion for 24h in 2 groups (×200)

圖2 2組大鼠cleaved-caspase-3蛋白含量Figure 2 Cleave-caspase-3 protein content in 2 groups of rats

如何選擇夾閉動(dòng)脈的位置也存在較大爭議，動(dòng)脈阻斷位置分別為腎動(dòng)脈下端部位[27]、腎動(dòng)脈上方0.5cm[28]或腎動(dòng)脈和主動(dòng)脈處等[29]。多種屬動(dòng)物的脊髓血供中有一條較大的根動(dòng)脈，稱為Adamkiewicz動(dòng)脈，可以供應(yīng)脊髓1/4～1/2的血液供應(yīng)，因此在這些動(dòng)物中阻斷該動(dòng)脈可以得到較佳的缺血損傷，包括人類[30-31]。SCHIEVINK等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)脊髓供應(yīng)的根動(dòng)脈無特殊差別，也就是不存在明確的Adamkiewicz動(dòng)脈。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)根動(dòng)脈之間無明顯差別，即沒有明確的Adamkiewicz動(dòng)脈，而且支配腰椎脊髓的根動(dòng)脈位于腎動(dòng)脈水平以上的腹主動(dòng)脈，因此本次研究選擇阻斷腎動(dòng)脈水平以上的腹主動(dòng)脈；另外，為了避免側(cè)支循環(huán)的影響，考慮到單純夾閉腹主動(dòng)脈造模效果不確切，本次研究選擇雙夾閉法進(jìn)行造模，另一處阻斷動(dòng)脈的位置定在左右髂總動(dòng)脈分叉處的腹主動(dòng)脈。

本研究顯示，通過對(duì)2組BBB評(píng)分和HE染色發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠發(fā)生SCII后，BBB評(píng)分較空白組明顯下降，脊髓組織中神經(jīng)元發(fā)生變性甚至壞死，炎性細(xì)胞局部浸潤。

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一種血紅素蛋白酶，由炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等分泌，因此可以用于評(píng)估炎性細(xì)胞的浸潤程度[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCII組大鼠脊髓組織中MPO活性高于Sham組，說明炎癥細(xì)胞浸潤參與了SCII的發(fā)病機(jī)制。Caspase-3是Caspase家族成員，在真核細(xì)胞的生長、分化與凋亡方面起重要的調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑的重要組成部分[35-38]。有研究發(fā)現(xiàn)[39-40]，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，可以通過Bcl途徑，上調(diào)Bax的表達(dá)，從而激活下游的Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因此，本研究通過Western blotting檢測(cè)Caspase-3剪切體水平發(fā)現(xiàn)，SCII組Caspase-3剪切體水平較Sham組明顯升高，說明Caspase-3參與了大鼠SCII的病理生理過程。

本研究通過改良的雙夾閉法阻斷腹主動(dòng)脈血供構(gòu)建大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，并通過運(yùn)動(dòng)康復(fù)學(xué)評(píng)估(BBB評(píng)分)、脊髓組織學(xué)形態(tài)(HE染色)、炎癥反應(yīng)(髓過氧化物酶)和凋亡(cleaved-caspase-3蛋白)證實(shí)了動(dòng)物模型的有效性。操作簡便，動(dòng)脈阻斷確切，神經(jīng)損傷明確，且重復(fù)性好，并發(fā)癥發(fā)生率小，是較為合理可靠的大鼠脊髓缺血再灌注損傷的構(gòu)建方法。