多發性硬化相關細胞因子的表達水平及和意義

韓 凌 徐婉茹

菏澤市立醫院神經內科，山東 菏澤 274000

多發性硬化(MS)是一類中樞神經系統脫髓鞘疾病，引起該病主要因素為自身免疫系統缺陷，為一種已達成共識的免疫性疾病[1]。既往研究認為[2]，該病發病機制與患者感染某種病毒有關，而感染病毒與中樞神經系統髓鞘存在相似抗原，上述兩種相似抗原引起錯誤的免疫識別，誘發自身免疫反應。目前部分研究證實[3]，MS疾病發生、發展過程中，CD4+T細胞在其中發揮一定作用，起介導作用。近年來，隨著醫學檢驗技術不斷發展，新型CD4+T效應性T細胞被發現，上述細胞分泌白介素-17等前炎性因子，在多種疾病中發揮重要作用，常見為自身免疫性疾病、感染和腫瘤。研究表明，動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠體內發現Th17所分泌細胞因子IL-17水平增高[4]。現階段對Th17細胞及其相關因子在MS疾病患者發表相關報道不多。本文探討多發硬化相關細胞因子的研表達水平其意義。

1 資料與方法

1．1一般資料抽取菏澤市立醫院2016-01-2017-12收治的MS患者60例為觀察組，另選取同期30例健康體檢者為對照組。納入標準[5-6]：(1)觀察組患者經臨床醫師診斷確診為MS；(2)治療依從性高，能配合醫護人員；(3)經過家屬、患者同意后自愿參與本次研究；(4)無自身免疫性疾病或服用免疫制劑者。排除標準：(1)障礙、失語、嚴重認知功能障礙者；(2)既往存在精神病史或家族史者；(3)一般資料不全者；(4)合并腦出血、腦梗死患者。對照組男18例，女12例，年齡28～54(41.5±3.4)歲。觀察組男45例，女15例，年齡27～52(42.6±3.7)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1．2方法

1．2．1 標本采集：收集外周靜脈血，放置于乙二胺四乙酸抗凝管中，5 mL/管，抽取2管。采取Ficoll分層法分離PBMCs，實驗過程中將濃度調整至2×106個/mL，實驗開展過程中及時將細胞懸液中往內添加單克隆體anti-CD3 0，2 μg/mL，anti-CD28 1 μg/mL。同時將細胞懸液分為三部分：①將其放置于6孔板內，同時往內部添加5% CO237 ℃，放置在孵箱中培育20 h，可提取RNA。②往內添加96孔板內，往內部添加于5% CO237 ℃，放置于孵箱中培育72 h，同時吸取上清液，采用ELISA檢測。③培養管內放置5 mL，并添加蛋白轉運阻滯劑，置于5% CO237 ℃孵箱內培育4 h，后予以細胞染色。

1．2．2 檢測：試驗檢測采取Trizol一步法，并提取單個核細胞RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。RT-PCR反應體系如下：Taq酶，IL-17，內參GAPDH上下游引物共0.5 μL，模板cDNA，MgSO4，dNTP共1 μL，5 μL 10×PCR Buffer，15 μL ddH2O，共50 μL。反應條件：預變性為5 min 95 ℃、30次循環次數，同時利用72 ℃延伸5 min。同時往內添加1.2%瓊脂糖凝膠，并在此基礎上于120 V下電泳，后采取Bio-capt凝膠成像系統對結果加強分析。引物為Primer 5.0設計，IL-17上引流物為5’-GGACTGTGATGGTCAACCTGA-3’，下引流物5-TCATGTGGTAGTCCACGTT-CC3’；GAPDH上游引物：5’-GCATGGCCTTCCGTGTCC-3’，下游引物：5’-TGAGTGTGGCAGGGACTC-3’。試驗開展過程中采取雙抗體夾心法，并利用ELISA試劑盒可對細胞上清液中IL-17、IL-6、IL-23進行操作，嚴格按照試驗說明書進行，試驗操作中標準品和標本各孔吸光度值讀取應在波長450 mm處。

1．2．3 治療：將納入60例MS患者(觀察組)按照殘疾狀況量表(EDSS)[6]分為3組，A組(EDSS<4分)24例，B組(EDSS≥4～6分)26例，C組(EDSS≥6～9分)10例，所有患者予以國藥集團容生制藥有限公司甲潑尼龍針(批準文號：國藥準字H20030727，劑量40 mg)治療，1周內前3 d 1.0 g肌內注射，1次/d，后4 d予以0.5 g肌內注射，1次/d。甲波尼龍沖擊治療后1周并予以許昌奧森制藥有限公司生產強的松片(批準文號：國藥準字H41021232，劑量5 mg)60 mg/d，漸遞減后1個月內停服，并予以胃黏膜保護劑，口服強的松片干預3周，共治療1個月。再次對各項因子進行檢測，操作方式同上。

1．3觀察指標觀察2組IL-17、IL-23、IL-6等因子水平，比較觀察組治療前后各項血清指數，分析治療前后MS患者相關細胞因子與EDSS的相關性。

2 結果

2．12組相關因子比較觀察組IL-17、IL-23、IL-6水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2．2A組、B組、C組治療前后相關因子比較治療前3組IL-17、IL-23、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)，治療后3組IL-17、IL-23、IL-6水平差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組相關因子比較

2．3治療前后IL-23、IL-17、IL-6與EDSS的相關性治療前IL-23與EDSS呈明顯負相關，IL-17與EDSS、IL-6與EDSS呈正相關，治療后IL-23與EDSS呈明顯負相關，IL-17與EDSS、IL-6與EDSS呈正相關。見表3。

3 討論

慢性進展性中樞神經系統脫髓鞘為MS特征性表現，全世界患病人數100萬，常見患病人群以中青年為主，患者臨床癥狀表現多以乏力、共濟失調、視野缺損等，會引起患者出現一系列認知障礙，常見為感覺、運動、神經，若早期未及時予以措施干預，會影響到后續自理能力，為家庭造成嚴重負擔[7-8]。目前MS發病機制不明確，除與自身免疫聯系密切外，病毒感染、遺傳傾向、環境因素等均在MS發病中起到作用[9-10]。現階段對MS相關病因研究側重點為動物實驗模型上，一項有關小鼠實驗結果證實，與正常小鼠群相比較，自身免疫性腦脊髓炎小鼠機體內部Th1細胞水平會呈現一定上升，相比自身分泌IL-12水平偏高，表明Th12參與疾病發病[11-12]。但另一項實驗顯示[13-14]，一旦阻斷機體內IL-12與其受體之間結合，或小鼠體內IL-12清除過后，小鼠仍然易感染自身免疫性腦脊髓炎。

Th17作為近年來研究中發現效應性CD4+T細胞，分泌IL-17、IL-23以及TNF-α等前炎性因子，并起到促炎作用。對臨床自身免疫疾病患者研究中，常見為系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等疾病，血清、局部組織檢測中發現Th17細胞高水平[15-16]。韋云飛[17]在一項小鼠實驗中發現，自身免疫性腦脊髓炎小鼠病情進展發生與機體內部IL-17、IL-6水平呈正相關，且對存在缺陷IL-17小鼠或IL-17受體經封閉處理后小鼠對腦脊髓炎反應性降低。研究證實[15]，Th17細胞在MS發病中發揮重要作用，而Th17細胞分化中最為重要的細胞因子分別為IL-6、IL-23、IL-21等。因此，對上述炎性因子在機體內水平及其激素治療對其影響進行研究，能闡明MS發病機制，為后續干預、治療提供理論依據[18-19]。

SHAYGANNEJAD等[20]研究得出，因IL-17因子會通過腦部血腦屏障，移行過程中進入中樞系統會進一步分泌IL-17及炎癥性CD4+T細胞，上述因子綜合作用下會加重患者病情，導致中樞炎癥性脫髓鞘，進一步促使MS患者病情發展。我國對Th17相關研究報道偏少，本研究顯示，與正常健康人群相比，MS患者機體內TH17相關因子水平升高(P<0.05)。MS患者體內Th17細胞比例顯著高于對照組，MS患者Th17細胞數量與其功能增強具有一致性[21-22]。IL-6和IL-23作為IL17緊密相連細胞因子，為抗原提呈細胞分泌，作為誘導初始CD4+T細胞向Th17細胞分化及其IL-17產生關鍵因子[23-24]。因此，MS患者Th17細胞增加與其誘導因子IL-6、IL-23密切相關。

表2 A組、B組、C組治療前后相關因子比較

表3 治療前后IL-23、IL-17、IL-6與EDSS相關性

甲潑尼龍作為急性期MS患者常用治療藥物。本文中MS患者按照ESDD分級分為3組，同樣予以激素治療，與治療前相比，IL-23、IL-17、IL-6水平均相應下降。雖然MS患者臨床癥狀緩解，但與健康人群相比，IL-23、IL-17、IL-6仍然偏高。國內外部分研究證實[25-26]，長期應用激素治療并不能有效改善MS患者預后，但予以適量延長激素治療是否能控制IL-23、IL-17、IL-6水平正常，并預防MS復發，仍需進一步研究。本文顯示，治療前后IL-23與EDSS呈明顯負相關，IL-17與EDSS、IL-6與EDSS呈正相關。提示上述3個炎性因子在MS發病中存在同向協調關系。而對MS臨床治療多采用甲波尼龍干預，臨床實際應用過程中能作為MS急性期治療用藥，進一步降低MS患者IL-17、IL-23、IL-6水平，為臨床治療提供佐證。但因長期應用大量激素干預，后續不良反應多，因此，為減少治療過程中對患者進一步損傷，尋找替代品顯得尤為重要[27-28]。IL-23和IL-17作為近些年來研究中對MS發生、發展中起重要作用的細胞因子，Th17細胞及其相關因子會參與MS進展，對其相關確切機制仍需進一步研究[29-30]。因此，對其深入研究能進一步揭示MS發生、發展機制，為尋求后續新的治療方法提供依據。在后續研究中，需要加大樣本量深入研究，以推進Th17細胞檢測在MS診斷中臨床應用[31-32]。

MS發病與IL-17、IL-23、IL-6相關，采取甲潑尼龍治療1個月，上述因子水平下降。但由于本文究仍建立在其他學者基礎上，對Th17相關作用機制尚不明確，因此，為進一步證實該研究準確性，需加大樣本量、研究時間，證實Th17細胞在MS診斷中的應用價值。