單孔孔板水力空化對大豆球蛋白理化性質的影響

王 芳，楊 鋒，任仙娥*，黃永春，黃承都，劉純友，張昆明，閻柳娟

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

空化技術是一項食品物理加工新技術。近年來，超聲空化已在食品蛋白質改性方面得到了國內外很多學者的關注和研究，如Jambrak[1]、Hu Hao[2]、涂宗財[3]等的研究結果表明超聲波產生的空化效應能使大豆蛋白的結構變得松散，分子間作用力減弱，平均粒徑減小，表面疏水性增加，二級結構發生改變，溶解性、乳化性增加，凝膠性等功能性質得到改善。然而，超聲空化因能量利用率較低、空化效應區域小等弊端，使得其應用規模受到限制。與超聲空化產生方法不同的水力空化由于所形成的空泡與液體一起做整體運動，可在較大范圍內形成比較均勻的空化場，加上能量利用率高，使得其更具工業化應用優勢[4]。水力空化是液體流經孔板、文丘里管、葉輪或轉子等時引起較大壓力波動產生的，其空化泡潰滅瞬間產生與超聲類似的空化效應，如剪切力、沖擊波、極端高溫和高壓、自由基等[5]。其中，由孔板產生水力空化具有空化場分布范圍廣、強度均勻、易實現等優點，近年來在廢水處理[6]、有機廢物的降解[7]、微生物細胞的破碎[8]和生物柴油的制備[9]等領域都有研究。

目前已有相關研究將基于渦流的水力空化用于米渣蛋白和大豆分離蛋白的改性，發現渦流空化在一定條件下能改善米渣蛋白和大豆分離蛋白的溶解性、乳化性和起泡性[10-12]，但是關于孔板水力空化在蛋白質改性方面還鮮見報道，因此本實驗利用單孔孔板水力空化技術處理大豆球蛋白，研究單孔孔板水力空化對大豆球蛋白理化性質的影響及作用機理，為將孔板水力空化技術應用到蛋白質的物理改性領域提供一定的理論依據及實踐探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕 大海糧油工業（防城港）有限公司。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1-苯胺-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）、對苯二甲酸、5,5'二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、丙烯酰胺、過硫酸銨、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R250 上海阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RF-5301PC型熒光分光光度計 日本島津公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；Nano ZS90納米粒度儀、Zeta電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；電泳系統 美國伯樂公司；JYD-650智能型超聲波細胞粉碎機 上海之信儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單孔孔板水力空化與超聲空化的空化產額比較

單孔孔板水力空化裝置示意圖如圖1所示，由貯罐、閥門、離心泵（功率550 W）、壓力表、孔板（孔直徑3 mm、厚度20 mm）、管路（直徑18 mm）組成。當流體流經孔板時，流速增大，壓力降低，當壓力低于該流體的飽和蒸汽壓時，流體汽化同時溶解在流體中的氣體釋放出來產生大量空化泡，當空化泡隨流體流到下游壓力恢復區時，空化泡潰滅，從而產生空化效應。為評價單孔孔板水力空化的空化效應，本研究采用對苯二甲酸熒光法測定該實驗裝置的空化產額，并與采用超聲空化處理的空化產額相比較[13]。配制2 mmol/L對苯二甲酸溶液，取700 mL進行超聲波處理（功率550 W），同時取700 mL進行單孔孔板水力空化處理（30 min），測定其在激發波長310 nm，發射波長425.6 nm，狹縫寬均為5 nm條件下的熒光強度，計算單孔孔板在水力空化和超聲空化下的空化產額。

圖1 單孔孔板水力空化裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of hydrodynamic cavitation in single hole orifice plate

1.3.2 大豆球蛋白的制備

參照Nagano等[14]的方法，將粉碎后的脫脂豆粕過80 目篩，按料液比1∶15（m/V）加入蒸餾水，然后用2 mol/L NaOH調節至pH 8.0，恒溫磁力攪拌1 h后在4 ℃、9 000×g下離心10 min，得上清液。再向上清液中加入0.01 mol/L NaHSO3，攪拌均勻后用2 mol/L HCl調節至pH 6.4，放入冰箱（4 ℃）中冷藏過夜，然后在4 ℃、6 500×g下離心10 min，沉淀即為大豆球蛋白。將沉淀透析脫鹽，再用2 mol/L NaOH調節至pH 7.5，冷凍干燥備用。

1.3.3 單孔孔板水力空化處理大豆球蛋白

將大豆球蛋白配成質量分數為3%的分散液，取700 mL倒入單孔孔板水力空化裝置的貯罐中，啟動裝置，開啟冷凝水使大豆球蛋白在整個處理過程中溫度不超過35 ℃，處理不同時間（5、10、20、30 min）后取樣測定其理化指標。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

配制質量分數為13%的分離膠和質量分數為4%的濃縮膠。將蛋白質樣品稀釋至3 mg/mL，取40 μL稀釋后的蛋白液與80 μL樣品緩沖液（非還原樣品緩沖液不加β-巰基乙醇）混合均勻后于95 ℃下加熱5 min，冷卻后上樣，上樣量為10 μL。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）時蛋白質樣品在濃縮膠中電流為16 mA，進入分離膠后將電流調為28 mA。SDS-PAGE結束后，先對其進行固定，然后采用考馬斯亮藍R250染色，再進行脫色，直至出現清晰的蛋白條帶為止，最后使用凝膠成像系統進行成像處理。

1.3.5 粒徑和Zeta電位的測定

將蛋白質樣品稀釋至3 mg/mL，于室溫下采用納米粒度儀測定各樣品的粒徑。再取樣品測定其Zeta電位，測定條件如下：1 cm聚苯乙烯池，一對0.45 cm2鉑電極，間距為0.4 cm，測定溫度為25 ℃，平衡時間為2 min。

1.3.6 內源熒光光譜的測定

參照Jiang Lianzhou等[15]的方法，將蛋白質樣品稀釋至0.6 mg/mL，采用熒光分光光度計測定，設置激發波長為290 nm，掃描發射波長范圍為300～400 nm，激發和發射狹縫寬度均為3 nm。

1.3.7 表面疏水性的測定

參照Haskard等[16]的方法，以ANS為熒光探針，將蛋白樣品用0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至不同質量濃度（0.005～0.5 mg/mL），取樣品4 mL，加入10 μL 8 mmol/L ANS溶液，混合均勻后，在熒光分光光度計下進行測定，設定激發波長為370 nm，發射波長470 nm，狹縫寬為5 nm。以熒光強度對蛋白質量濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為蛋白質的表面疏水性。

1.3.8 巰基含量的測定

參考Hu Hao等[17]的方法，將蛋白樣品稀釋至10 mg/mL，取2 mL蛋白溶液，加入5 mL測試液（pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液用于暴露巰基含量的測定，Tris-甘氨酸-8 mol/L尿素溶液用于總巰基含量的測定），添加100 μL DTNB溶液（4 mg/mL），在25 ℃恒溫搖床中振蕩1 h后，于7 000×g離心10 min，得到上清液，以2 mL蒸餾水加5 mL測試液、100 μL DTNB為空白對照，然后測定其在412 nm波長處的吸光度。按下式計算巰基含量。

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；D為稀釋倍數；73.53為106/（1.36×104），其中1.36×104是摩爾消光系數/（L/（mol·cm））。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 單孔孔板水力空化和超聲空化的空化產額比較

表1 單孔孔板水力空化和超聲空化的空化產額的計算及比較Table 1 Comparison of cavitation yields of ultrasonic and hydrodynamic cavitation

單孔孔板水力空化和超聲空化的空化產額計算及二者之間的比較如表1所示。在相同的輸入功率、處理時間和體積下，單孔孔板水力空化處理對苯二甲酸得到的產物2-羥基對苯二甲酸的濃度為1.34×10－5mol/L，而超聲空化處理得到的產物濃度為1.91×10－6mol/L，單孔孔板水力空化的空化產額約是超聲空化的7 倍。Kumar等[18]利用碘化鉀的方法來比較孔板水力空化和超聲空化的空化產額時發現，孔板水力空化的空化產額是超聲空化的2～3 倍，并且他們認為超聲空化產額較低的原因是超聲波的能量利用率較低，而水力空化裝置中用到泵，該泵的能量利用率隨著單位時間內處理體積的增加而增大，因此水力空化在處理大體積樣品時其空化產額較高。

2.2 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白理化性質的影響

2.2.1 SDS-PAGE分析

圖2 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白分子質量的影響Fig. 2 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on molecular mass of soybean globulin

如圖2所示，還原條件下的SDS-PAGE圖譜清晰地顯示出大豆球蛋白的特征條帶，其中酸性多肽（acidic subunit，AS）分子質量約為35 kDa，堿性多肽（basic subunit，BS）分子質量約為20 kDa，但是也混有少量的β-伴大豆球蛋白的β亞基條帶（分子質量約為52 kDa），通過光密度分析，大豆球蛋白純度可達85%以上。從還原條件下的SDS-PAGE圖譜中還可以看出，單孔孔板水力空化處理未引起大豆球蛋白各條帶位置的變化，說明單孔孔板水力空化處理未改變大豆球蛋白的分子質量分布。超聲波在處理蛋白質時，很多情況下也未引起蛋白質分子質量發生改變。如Hu Hao等[2]在研究超聲波處理大豆分離蛋白時，大豆分離蛋白在不同超聲波功率（200～600 W）下處理15～30 min后其分子質量分布未發生變化。O'Sullivan等[19]發現超聲波處理也未能改變小麥蛋白和大豆分離蛋白的分子質量分布，他們認為實驗中超聲波提供給被處理樣品的能量不足以讓肽鍵和二硫鍵斷裂，只能破壞一些非共價鍵。

從圖2非還原條件下的SDS-PAGE圖譜中可知，由于非還原電泳處理樣品時未添加β-巰基乙醇，即未打開蛋白質分子的二硫鍵，AS和BS之間通過二硫鍵形成AB亞基分布在43.0～66.2 kDa之間，條帶沒有變化，說明二硫鍵未出現斷裂，也沒有新的二硫鍵生成。但是，Hu Hao等[17]利用超聲波處理大豆球蛋白時發現，非還原條件下SDS-PAGE圖譜中大分子質量處由二硫鍵形成的聚集物有所增加。這與本研究的結果不一致，說明不同的處理方式對大豆球蛋白亞基結構的影響不同。

2.2.2 粒徑分布

由圖3可知，未處理的大豆球蛋白粒徑呈多峰分布，共有3 個峰，分別在0～100、100～1 000、1 000～10 000 nm處。經單孔孔板水力空化處理后，其粒徑分布發生變化。處理5 min后，在1 000～10 000 nm處的峰仍然存在，但是其強度變弱；處理10 min后，在1 000～10 000 nm處的峰消失。處理之后的樣品，粒徑分布在0～100 nm和100～1 000 nm處的峰都向左偏移。

圖3 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白粒徑分布的影響Fig. 3 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on particle size distribution of soybean globulin

圖4 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白平均粒徑的影響Fig. 4 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on average particle size of soybean globulin

從圖4可以看出，單孔孔板水力空化處理可顯著降低大豆球蛋白的平均粒徑（P＜0.05），處理30 min后大豆球蛋白的平均粒徑由（335.67±3.43）nm減小至（234.73±4.32）nm。大豆球蛋白平均粒徑的減小可能是由于單孔孔板水力空化產生的空化效應如高剪切力、沖擊波、微射流以及湍流等作用，破壞了蛋白質分子間的作用力，使大豆球蛋白中大的聚集體解離成小的聚集體。Yang Feng等[12]的研究結果也表明基于渦流的水力空化在0.6 MPa下處理60 min，能使大豆分離蛋白的粒徑從（115.43±5.89）μm減小至（15.93±3.94）μm。關于超聲波處理對不同蛋白質粒徑的影響也有報道，如Jambrak等[1,20]研究發現超聲波處理使大豆蛋白和乳清蛋白的平均粒徑減小。Hu Hao等[17]的研究結果表明經400 W超聲波處理40 min后β-伴大豆球蛋白的平均粒徑從75.9 nm減小至51.8 nm。他們認為粒徑的減小可能是超聲波產生的空化效應破壞了蛋白分子間的相互作用，使聚集體解離引起的。由此可見，單孔孔板水力空化同渦流水力空化和超聲波等物理改性方式效果相當，都能引起蛋白質分子中聚集體的解離，從而導致其平均粒徑減小。但是，需要說明的是，超聲波處理也能引起蛋白質分子的聚集，而使其平均粒徑增加。如Arzeni等[21]利用超聲波處理蛋清蛋白、Gülseren等[22]利用超聲波處理牛血清蛋白時，發現這些蛋白質經超聲波處理后能產生一些小的聚集體而使其平均粒徑增加。這可能與超聲波處理時所用的功率和時間不同以及處理樣品的濃度、組成及構象不同有關。

2.2.3 Zeta電位

圖5 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白Zeta電位的影響Fig. 5 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on zeta potential of soybean globulin

Zeta電位可以反映蛋白質表面電荷的分布情況。通常，當蛋白質表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時，其Zeta電位為負值，反之則為正值[23]。Zeta電位的絕對值越大，表明體系越穩定。由圖5可以看出，大豆球蛋白經單孔孔板水力空化處理5 min后，其Zeta電位絕對值顯著增加（P＜0.05）；延長處理時間，Zeta電位絕對值繼續增加，但是增加程度不顯著（P＞0.05）。未處理時大豆球蛋白Zeta電位絕對值為（24.47±0.51）mV，處理30 min后其Zeta電位絕對值增加至（31.30±2.74 ）mV。這可能是因為，單孔孔板水力空化產生的空化效應改變了蛋白分子結構，使更多帶負電荷的氨基酸殘基暴露于蛋白分子表面，導致Zeta電位絕對值增加。另外，大豆球蛋白經空化處理后平均粒徑減小（圖4），蛋白分子中一些大的聚集體解聚，讓更多的帶負電荷的氨基酸殘基暴露于分子表面，也使Zeta電位絕對值增加。Gülseren等[22]研究結果表明超聲波處理使牛血清白蛋白的分子結構和構象發生變化，處理45 min后Zeta電位絕對值從處理前的27.4 mV增加至36.3 mV。Nazari等[24]發現，超聲波處理能使粟米濃縮蛋白分子表面暴露更多的帶負電荷的氨基酸殘基，Zeta電位的絕對值由32.9 mV增加到42.2 mV。由此可見，單孔孔板水力空化與超聲波處理一樣能使蛋白質分子結構發生改變，更多的帶負電荷的氨基酸殘基暴露于蛋白分子表面，使Zeta電位絕對值增加，但是增加的程度與處理方式有關。

2.2.4 內源熒光光譜

色氨酸內源熒光光譜是一種比較靈敏的在三級結構水平反映蛋白質構象變化的技術手段。內源熒光光譜最大吸收峰（λmax）向長波長方向移動（紅移）表明蛋白質的結構變得松散，色氨酸處于極性更大環境中；λmax向短波長方向移動（藍移），表明蛋白質分子結構變得緊湊，色氨酸處于疏水性更大的環境中；若λmax沒有發生偏移，僅僅有熒光峰信號增強或減弱，則不能將其判斷為明顯的蛋白構象改變[25]。如圖6所示，經單孔孔板水力空化處理30 min后，大豆球蛋白的λmax從329 nm紅移至333 nm，說明大豆球蛋白分子結構發生變化，色氨酸處于極性更大的環境中，這可能是因為單孔孔板水力空化產生的高剪切力、沖擊波、微射流及湍流等空化效應破壞了蛋白質分子間的相互作用力，使其結構變得更加松散，色氨酸的微環境變得更加親水。Jiang Lianzhou等[15]研究超聲波處理對黑豆分離蛋白的影響，發現經超聲波處理后，蛋白樣品的λmax紅移，表明超聲波破壞了蛋白分子間的相互作用，使色氨酸基團暴露于外界，導致它們微環境的極性增加，這與本研究結果一致。由圖6還可以看出，經單孔孔板水力空化處理后大豆球蛋白的熒光強度增加，這可能是因為單孔孔板水力空化處理使大豆球蛋白分子中暴露的色氨酸發色團與熒光猝滅劑的相互作用減弱引起的[26]。

圖6 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白內源熒光光譜的影響Fig. 6 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on intrinsic emission fluorescence spectrum of soybean globulin

2.2.5 表面疏水性

圖7 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白表面疏水性的影響Fig. 7 Effect of hydrodynamic cavitation in single hole orifice plate on surface hydrophobicity of soybean globulin

蛋白質表面疏水性的大小取決于其疏水性基團的暴露程度，是影響蛋白質的功能性質如乳化性和起泡性的重要因素[27]。如圖7所示，大豆球蛋白經單孔孔板水力空化處理10 min后，其表面疏水性未發生顯著變化（P＞0.05），但是處理20 min后，其表面疏水性顯著增加（P＜0.05），處理30 min后表面疏水性由處理前的1 970.67±35.00增加至2 373.67±75.57。之前的研究結果也表明經渦流空化處理過的大豆分離蛋白的表面疏水性是未處理組的2 倍[12]。常海霞等[28]發現草魚肌肉肌原纖維蛋白經超聲波處理后包埋在分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露至分子表面，處理20 min后其表面疏水性增加3.8 倍。本研究中大豆球蛋白表面疏水性的增加意味著在單孔孔板水力空化處理過程中大豆球蛋白結構的展開和疏水性基團的暴露，圖5中Zeta電位絕對值的增加也印證了這一點。此外，如圖4所示，單孔孔板水力空化處理后大豆球蛋白的粒徑減小，說明空化效應破壞了分子之間的交聯作用，使一些大的聚集體解聚，也導致一些疏水性基團暴露，從而導致表面疏水性增加。

2.2.6 巰基含量

圖8 單孔孔板水力空化對大豆球蛋白巰基含量的影響Fig. 8 Effect of hydrodynamic cavitation in single-hole orifice plate on exposed and total sulfhydryl contents of soybean globulin

巰基基團是蛋白質中活性最強的官能團之一，也是影響蛋白質功能性質的重要因素[26]。由圖8可以看出，經單孔孔板水力空化處理后，暴露巰基和總巰基含量隨著空化時間的延長而降低，處理30 min后暴露巰基和總巰基含量分別由未處理的（5.11±0.35）μmol/g和（7.31±0.27）μmol/g降低至（3.76±0.16）μmol/g和（5.35±0.28）μmol/g。暴露巰基和總巰基含量的降低可能是巰基和二硫鍵之間發生互相轉換，但是結合前面SDS-PAGE圖譜（圖2）來看，在非還原條件下，大豆球蛋白的各個條帶位置并未發生變化，沒有新的條帶出現，說明沒有新的二硫鍵形成，因此減少的巰基并沒有形成二硫鍵。值得注意的是，空化效應中一個很重要的效應是水分子斷裂產生自由基，如·H和·OH，·OH具有強氧化性，可以將巰基氧化成次磺酸或磺酸基，導致巰基含量降低。常海霞等[28]在研究超聲波對草魚肌肉肌原纖維蛋白理化性質的影響時也發現超聲波空化效應產生的·OH也使肌原纖維蛋白分子的暴露巰基和總巰基含量均減少。Hu Hao等[17]也發現超聲波處理使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的暴露巰基和總巰基含量均減少，這些與本研究結果一致。

2.3 各理化指標之間的相關性

表2 大豆球蛋白各理化指標之間的相關性分析Table 2 Pearson correlation coefficients of physicochemical properties of soybean globulin

為了更好地了解單孔孔板水力空化處理大豆球蛋白平均粒徑、Zeta電位絕對值、表面疏水性、暴露巰基含量和總巰基含量等理化指標之間的關聯，對這些理化指標進行相關性分析，結果如表2所示。大豆球蛋白的平均粒徑與Zeta電位絕對值之間存在顯著負相關（r=－0.900）（P＜0.05），與暴露巰基含量（r=0.933）和總巰基含量（r=0.959）之間均存在顯著正相關（P＜0.05、P＜0.01）；Zeta電位絕對值與總巰基含量之間存在顯著負相關（r=－0.894）（P＜0.05）；表面疏水性與暴露巰基含量之間存在顯著負相關（r=－0.928）（P＜0.05）；暴露巰基含量與總巰基含量之間存在極顯著正相關（r=0.959）（P＜0.01）。這些結果表明，在單孔孔板水力空化處理過程中，隨著大豆球蛋白平均粒徑的減小，大的聚集體解聚，更多的帶負電荷的氨基酸殘基暴露，Zeta電位絕對值增加；由于蛋白分子展開導致更多的疏水性氨基酸殘基也暴露出來，蛋白表面疏水性增加。但是蛋白分子的展開并沒有引起暴露巰基含量的增加，而是使其減小（圖8），其原因可能是暴露巰基瞬間被空化過程中產生的·OH氧化，并且被氧化的速率大于其暴露的速率。

3 結 論

大豆球蛋白經單孔孔板水力空化處理后，分子質量分布未發生變化，平均粒徑減小，Zeta電位絕對值增加，內源熒光光譜最大吸收峰紅移，表面疏水性增加，暴露巰基含量和總巰基含量均降低。由此可見，單孔孔板水力空化對大豆球蛋白的改性有一定效果，這對豐富食品蛋白質的物理改性途徑、將水力空化技術應用到食品蛋白質的生產中具有一定意義。關于單孔孔板水力空化處理對大豆球蛋白功能性質的影響以及對β-伴大豆球蛋白理化和功能性質的影響有待進一步研究。