超聲波輔助提取杭白菊總黃酮工藝條件的優化

高 紅，王書琪，孔曉妍，郭黎媛

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032205）

杭白菊為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，亦名小湯黃、小白菊，與毫菊、滁菊、貢菊并稱為中國馳名的四大名菊。杭白菊性微寒，味苦、甘，歸肺、肝經，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒之功效，用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[1]。杭白菊的化學成分主要包括黃酮類、揮發油、三萜類、甾體類、酚類、多糖及微量元素等，藥效物質基礎主要為黃酮類、揮發油類成分[2]。黃酮類物質是杭白菊的主要生物活性成分之一，包括黃酮、黃酮醇和黃烷酮3 類[3]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功能[4-5]。杭白菊總黃酮提取方法有直流回流法[6]、浸提法[7]等，本研究采用超聲波輔助提取法，具有時間短、提取效率高的特點。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：杭白菊；65%vol汾酒優質大曲。

試劑：乙醇；蘆丁對照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH；Rutin hydrate C 168000；Lot：80212 0.5 g 98.0 % Rcode 36137138S-code22-25）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；蒸餾水。

儀器設備：超聲波清洗器，LQ-300DE 昆山超聲波儀器有限公司；紫外可見分光光度計，UV-2450 日本島津公司；電子天平，AB204-S 梅特勒公司；容量瓶；移液管；三角瓶；燒杯；玻璃棒；量筒；濾紙；漏斗；微量進樣器；膠頭滴管。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

表1 超聲波提取杭白菊總黃酮正交試驗因素水平

1.2.1.1 蘆丁標準溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品7.5 mg，加入50%vol 乙醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，制成0.15 mg/mL的標準品溶液。

吸取蘆丁標準品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻并靜置6 min，再加入10 %氫氧化鋁溶液0.3 mL，搖勻并放置6 min，最后加入4 %氫氧化鈉溶液4 mL，加50%vol乙醇稀釋至刻度，搖勻并放置15 min。

用另一10 mL 容量瓶在不加蘆丁標準溶液的基礎上重復上述加樣步驟作為空白對照，在200～600 nm 波長范圍內進行紫外掃描，選擇最大吸收峰所在波長為后續測定波長。

1.2.1.2 蘆丁標準曲線的繪制

準確量取1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL蘆丁標準品溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.1.1 方法在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度A 為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，線性回歸得到標準曲線。

1.2.2 杭白菊單因素試驗

1.2.2.1 乙醇濃度的單因素試驗

將杭白菊以1∶20 的比例分別浸泡在40%vol、50%vol、60%vol、70%vol、80%vol 的乙醇溶液中，24 h 后在60℃、50 Hz 下超聲提取50 min，將三角瓶取出，過濾后取0.1 mL上清液測定。

1.2.2.2 料液比的單因素試驗

將杭白菊分別以1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，24 h 后在60 ℃、50 Hz 下超聲提取50 min，取出三角瓶，過濾收取0.1 mL上清液測定。

1.2.2.3 提取時間的單因素試驗

將杭白菊以1∶10 的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，在60 ℃、50 Hz下分別超聲提取30 min、50 min、70 min、90 min、110 min，在不同時間將三角瓶取出，過濾取0.05 mL上清液測定。

1.2.2.4 提取溫度的單因素試驗

將杭白菊以1∶10 的比例浸泡于70 %vol 的乙醇中，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取70 min 后將三角瓶取出，過濾取0.05 mL 上清液測定。

1.2.3 杭白菊正交試驗

通過以上單因素試驗針對各因素分別篩選出以下范圍進行4 因素3 水平的正交試驗，結果見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準 曲 線：y=14.786x-0.0079，R2=0.9991。結果 見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 杭白菊單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度相關試驗（圖2）

如圖2 所示，在乙醇濃度達到70%vol 時，杭白菊黃酮的提取量最大，這說明乙醇濃度的提高有助于杭白菊黃酮的提取，但當濃度進一步增大時，醇溶性雜質會進一步增多，反而不利于細胞內黃酮的溶出，最佳乙醇濃度選擇70%vol。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.2.2 料液比相關試驗（圖3）

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響

如圖3 所示，隨著料液比提取出的總黃酮量持續下降，當料液比為1∶9 時提取量達到最高值；但繼續增大溶劑用量至料液比為1∶21 時，提取量反而下降。表明適度增加溶劑可能有利于黃酮溶出，但過多的溶劑使黃酮的溶解量趨于飽和，從而增加杭白菊內其他醇溶性雜質的溶出。因此，根據實際生產情況確定最佳料液比為1∶10。

2.2.3 提取時間相關試驗（圖4）

圖4 提取時間對總黃酮提取量的影響

如圖4 所示，當提取時間為70 min 時，杭白菊黃酮提取量最高；當進一步延長超聲作用時間，黃酮得量反而有輕微下降，原因可能是長時間的超聲作用改變了超聲環境，會破壞黃酮化合物的結構，因此超聲時間選擇70 min為宜。

2.2.4 提取溫度相關試驗（圖5）

圖5 提取溫度對總黃酮提取量的影響

如圖5 所示，當提取溫度在30～50 ℃時，提取的總黃酮量隨提取溫度的升高而升高，當提取溫度為50 ℃時，總黃酮提取量最大；當提取溫度為60 ℃時，總黃酮提取量反而有一定幅度下降；其中在提取溫度范圍為30～50 ℃時，總黃酮提取量隨溫度上升而顯著升高，說明此范圍內提取溫度的升高能促進超聲波對杭白菊細胞結構的損壞，從而有利于總黃酮的溶出；但是當溫度繼續升高時，過高的溫度會影響細胞內蛋白質的變性凝固，阻礙細胞中總黃酮的溶出，從而使總黃酮提取量下降。因此，確定最佳提取溫度為50 ℃。

2.3 杭白菊正交試驗（表2、表3）

表2 超聲波提取杭白菊總黃酮正交試驗表

由表3 可知，料液比對總黃酮提取的影響呈顯著差異。從極差分析可以看出，影響最大的因素為料液比，影響最小的為乙醇濃度；4 個影響因素的主次順序依次為B＞C＞D＞A，即料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度。綜合以上分析結果，確定超聲波提取杭白菊總黃酮的最佳工藝條件為A3B1C3D2，即乙醇濃度70 %vol，料液比1∶10，提取時間90 min，提取溫度50 ℃。

表3 杭白菊總黃酮提取正交試驗方差分析表

2.4 最佳工藝驗證結果

為了確認正交試驗得到的優化組合條件A3B1C3D2的可靠性，進行了優化組合的驗證試驗以乙醇濃度70 %vol、料液比1∶10、提取時間90 min、提取溫度60 ℃為提取條件進行杭白菊總黃酮提取。3 次重復后，總黃酮提取量分別為4.402 g/L、4.477 g/L、4.422 g/L，平 均 值4.434 g/L，RSD 為0.876 %，均高于正交試驗中的任意組合的總黃酮超聲波提取量，說明本工藝穩定可行。

3 討論

本研究結果表明，杭白菊總黃酮超聲波提取工藝的最佳條件為：乙醇濃度70%vol、料液比1∶10、提取時間90 min、提取溫度60 ℃。在此提取工藝條件下，總黃酮的提取量為4.434 g/L。這一研究結果與傳統浸提法相比，在縮短提取時間的同時提高了總黃酮的提取效率。