葡萄籽原花青素對缺血性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及MAPK/ERK1/2通路的影響①

吳婷玉 周景芬

(武漢市第一醫院老年病科，武漢430000)

缺血性心力衰竭(Ischemic heart failure，IHF)可導致心肌組織缺血缺氧，心肌細胞壞死，心肌間質纖維化等病變，影響心臟功能[1]。研究發現，缺血性心力衰竭的發生與心肌間質纖維化密切相關，細胞自噬是真核生物特有的一種自我保護機制，可消化大分子物質、受損細胞器等并進行循環利用，在心肌病變過程中具有重要作用[2]。隨著分子生物學的進展，信號通路在疾病發展中的作用逐漸受到重視。有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)系列通路，作為機體中重要的信號轉導通路之一，參與調控細胞增殖、凋亡等生物學過程，其中MAPK磷酸化后可級聯激活下游凋亡相關蛋白表達，促進心肌細胞凋亡[3]。研究表明，MAPK過度激活與缺血性心肌損傷密切相關，抑制MAPK活性可有效改善心臟功能[4]。據此推測，靶向MAPK的新藥物開發可為缺血性心力衰竭的臨床治療提供新思路。近年研究表明，葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)具有抗凋亡、抗氧化、抗心血管疾病等多種藥理作用[5]。然而，GSPE對缺血性心力衰竭所致心臟損傷的保護作用及機制尚不明確。本研究構建缺血性心力衰竭大鼠模型，觀察GSPE對缺血性心力衰竭大鼠心臟功能的保護作用并初步探討其作用機制，試圖為GSPE應用于缺血性心力衰竭的治療提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重170～200 g，許可證號：SCXK(滬)-2014-0001，購自上海邦耀生物公司。所有實驗SD大鼠均于本院實驗動物管理中心集中進行常規飼養，適應1周后隨機選取一定數量大鼠用于研究。本研究成功復制IHF模型大鼠75只，隨機分成5組：IHF組、低劑量GSPE組、中劑量GSPE組、高劑量GSPE組和陽性對照卡普托利組。自術后第一天起，分別給予各組大鼠相應藥物(以生理鹽水溶解)處理，低、中、高劑量GSPE組：給予50 mg/kg GSPE、100 mg/kg GSPE、200 mg/kg GSPE灌胃給藥；卡普托利組：給予300 mg/kg卡普托利灌胃給藥；對照組和模型組：給予等體積生理鹽水灌胃處理。各組大鼠均每天定時灌胃給藥1次，灌胃容積為1 ml/100 g，持續4周。

1.1.2 主要試劑及儀器 葡萄籽原花青素(GSPE)(含量≥95.0%，貨號：hbyc1652)購自湖北遠成科技生物公司；卡普托利(Captopril，CAPT)(規格：12.5 mg×100粒，貨號：C14200011098)購自上海施貴寶制藥有限公司；蛋白抽提試劑盒、戊二醛、戊巴比妥鈉購自碧云天公司；DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司；兔源一抗cleaved-caspase9抗體(貨號：ab25758)、cleaved-caspase3抗體(貨號：ab90437)、JNK抗體(貨號：ab208035)、ERK1/2抗體(貨號：ab115799)、p38MAPK抗體(貨號：ab126425)、p-JNK抗體(貨號：ab76572)、p-ERK1/2抗體(貨號：ab200807)、p-p38MAPK抗體(貨號：ab207483)、GAPDH抗體(貨號：ab181602)、羊抗兔二抗抗體(貨號：ab6721)均購于美國Abcam公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司等。

1.2 方法

1.2.1 CHF模型的制備 參照文獻[6]中方法復制缺血性心力衰竭模型大鼠。手術前，將2.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)注射進大鼠腹腔進行麻醉。徹底麻醉后，將大鼠固定在手術臺上(仰臥位)，沿腹部中線切開腹腔，暴露出腹主動脈和下腔靜脈。在距大鼠髂骨動脈根部上方約3 mm處夾閉腹主動脈，并做U形縫合，將18G留置針于縫合處貼血管前壁向上穿刺進入腹主動脈，小心沿右上方向推行，至腹腔靜-動脈聯合壁時，刺破進入下腔靜脈造瘺，拔除穿刺針，打緊U型縫合線，逐層縫合腹部肌肉并消毒，成功構造慢性心衰模型。對照組只穿刺腹主動脈不刺破下腔靜脈，其余操作均同模型組。術后統一進行常規喂養。若造模大鼠數量不足預定數量，則通過隨機原則取備用大鼠補足。

1.2.2 大鼠超聲心臟血流動力學檢測 GSPE作用4周后，采用上述方法麻醉各組大鼠，分別行多普勒彩色超聲心臟血流動力學檢測，在超聲二維影像指導下，檢測并記錄大鼠心率(Heart rate，HR)、左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure，LVSP)、平均動脈壓(Mean arterial pressure，MAP)以及左心室舒張末壓(Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，連續檢測3個心臟周期，計算平均值。

1.2.3 標本采集 心臟超聲血流動力學檢測完成后，處死各組大鼠(每組15只)，迅速取出心臟，摘除非心肌其他組織，將心室直徑最大處心肌組織剪切為1 cm×1 cm×1 cm組織，部分浸泡于福爾馬林緩沖液(10%)固定24 h，制備石蠟切片備用，部分浸泡于4%戊二醛固定；另取部分心肌組織切碎，在液氮中迅速冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.4 心肌組織形態學觀察 將上述心肌組織切片脫蠟、乙醇水合、洗滌后，采用蘇木精(Hematoxylin，H)-伊紅(Eosin，E)逐步對切片染色，最后洗去多余染液，采用中性樹膠封片，采用光學顯微鏡觀察大鼠心肌組織形態并拍照記錄。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 將心肌組織制備冷凍切片(7 μm/片)，采用TUNEL染色試劑盒(綠色熒光)處理切片，然后以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(藍色熒光)對細胞核染色，將切片置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照，以綠色熒光強度與藍色熒光強度的比值表示TUNEL陽性細胞比例，即凋亡細胞比例。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析 研磨大鼠心肌冷凍組織，提取組織中總蛋白，定量后，采用SDS-凝膠電泳分離分子量不同的蛋白質，轉印至PVDF膜。首先加入5%脫脂奶粉，封閉PVDF膜1 h；然后分別加入兔源cleaved-caspase9抗體、cleaved-caspase3抗體、ERK1/2抗體、p38MAPK抗體、p-ERK1/2抗體、p-p38MAPK抗體、GAPDH抗體等一抗(1∶500)，4℃孵育過夜；之后加入與HRP綴合的羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h；最后經增強型化學發光試劑處理后，采用Tanon軟件采集圖像并對蛋白條帶灰度進行分析。

2 結果

2.1 大鼠心臟血流動力學的變化 與對照組比較，IHF組大鼠HR、LVEDP明顯升高(P<0.05)，MAP、LVSP明顯降低(P<0.05)。與IHF組比較，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠HR、LVEDP均明顯降低(P<0.05)，MAP、LVSP均明顯升高(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠HR、LVEDP、MAP、LVSP均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 大鼠心肌組織形態學改變 對照組心肌細胞排列規則、緊密，肌原纖維完整，組織結構正常。IHF組心肌細胞細胞破碎、排列疏松，肌原纖維破裂，組織中出現炎性細胞，呈現病理損傷狀態。低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組心肌細胞排列趨于規則，壞死細胞減少，肌原纖維逐漸完整。高劑量GSPE組與卡普托利組心肌組織形態趨于一致，見圖1。

2.3 大鼠心肌細胞凋亡的比較 與對照組比較，IHF組大鼠TUNEL陽性心肌細胞比例明顯升高(P<0.05)；與IHF組比較，低、中、高劑量GSPE組大鼠TUNEL陽性心肌細胞比例明顯降低(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠TUNEL陽性心肌細胞比例無明顯差異(P>0.05)，見圖2、表2。

圖1 心肌組織HE染色結果(×200)Fig.1 HE staining results of myocardial tissue(×200)

GroupsHR(beats/min)LVEDP(mmHg)MAP(mmHg)LVSP(mmHg)Ctrl487.75±24.327.75±1.03120.67±15.86146.25±13.78IHF559.27±29.141)16.28±3.351)93.53±13.791)108.76±12.351)CAPT495.64±30.861)2)6.57±1.161)2)119.21±10.571)2)133.74±11.481)GSPE-L543.14±26.781)2)3)12.58±1.961)2)3)108.13±13.951)2)3)116.51±13.161)2)3)GSPE-M522.06±26.171)2)3)8.06±1.231)2)3)115.34±12.141)2)3)128.31±10.171)2)3)GSPE-H490.27±25.211)2)6.34±1.091)2)121.03±9.631)2)132.56±9.761)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

2.4 大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達的比較 與對照組相比，IHF組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯增加(P<0.05)。與IHF組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達量水平明顯降低(P<0.05);與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平無明顯差異(P>0.05)，見圖3、表3。

圖2 TUNEL法觀察心肌細胞凋亡(×100)Fig.2 Apoptosis of myocardial cell by TUNEL(×100)

GroupsApoptosis ratio(%)Ctrl6.54±1.08IHF41.82±9.461)CAPT9.43±2.041)2)GSPE-L32.51±7.321)2)GSPE-M19.36±3.871)2)3)GSPE-H8.94±2.111)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

圖3 WB檢測凋亡蛋白表達情況Fig.3 Expression of apoptosis-rated protein detected by WB

2.5 大鼠心肌組織MAPK通路相關蛋白表達的比較 與對照組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白總相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，IHF組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)。與IHF組相比，低、中、高劑量GSPE組和卡普托利組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與卡普托利組比較，高劑量GSPE組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平無明顯差異(P>0.05)，見圖4、表4。

Groupscleaved-caspase9/GAPDHcleaved-caspase3/GAPDHCtrl0.38±0.040.49±0.08IHF2.09±0.121)2.31±0.171)CAPT0.35±0.051)2)1.29±0.041)2)GSPE-L1.87±0.081)2)3)2.05±0.111)2)3)GSPE-M1.16±0.071)2)3)1.78±0.151)2)3)GSPE-H0.43±0.071)2)1.25±0.081)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

圖4 WB檢測各組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白表達情況Fig.4 Expression of ERK1/2，MAPK，JNK protein detected by WB

GroupERK1/2/GAPDHp-ERK1/2/GAPDHp38MAPK/GAPDHp-p38MAPK/GAPDHJNK/GAPDHp-JNK/GAPDHCtrl3.23±0.650.32±0.092.01±0.410.63±0.141.12±0.220.49±0.12IHF3.17±0.632.51±0.511)1.92±0.381.95±0.381.21±0.241.23±0.251)CAPT3.16±0.641.68±0.351)2)1.98±0.390.54±0.121)2)1.19±0.230.41±0.091)2)GSPE-L3.19±0.662.26±0.491)2)3)1.87±0.361.78±0.241)2)3)1.23±0.241.01±0.211)2)GSPE-M3.22±0.651.89±0.431)2)3)1.94±0.371.05±0.191)2)3)1.15±0.230.47±0.111)2)3)GSPE-H3.24±0.641.57±0.291)2)1.89±0.380.57±0.131)2)1.14±0.220.38±0.071)2)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；Compared with the IHF group，2)P<0.05；compared with the CAPT group，3)P<0.05.

3 討論

心力衰竭是指由于心臟功能損傷導致靜脈系統血液積滯、動脈系統血供不足，進而引起心臟循環障礙，是臨床上多種心血管疾病的終末階段，具有預后差、致殘致死率高等特點，嚴重威脅人類生命安全，逐漸成為一種世界性健康問題[7，8]。本研究采用動脈-靜脈造瘺法制備缺血性心力衰竭大鼠模型，結果顯示，缺血性心力衰竭大鼠HR、LVEDP明顯升高，MAP、LVSP明顯降低，大鼠心肌細胞壞死、心肌纖維斷裂，表明造模大鼠心臟收縮舒張功能降低、心肌組織出現明顯損傷，提示造瘺法可成功復制缺血性心力衰竭模型。

GSPE是一種從葡萄籽提取分離的天然化合物，屬于多酚類物質，可抑制氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等，常用于抗氧化、抗衰老等[9，10]。研究表明，GSPE通過激活自發性高血壓大鼠的抗氧化損傷系統，改善大鼠心臟收縮舒張功能，推測GSPE可增強高血壓大鼠心臟功能[11]。Vijayakumar等[12]發現，GSPE可通過抑制氧化應激反應，有效抑制年齡相關性大鼠心肌細胞凋亡，保護大鼠心臟功能。本研究發現，GSPE作用4周后，IHF大鼠的HR、LVEDP顯著降低，MAP、LVSP顯著升高，心肌病理損傷程度明顯減輕，與卡普托利作用效果一致，提示GSPE可改善缺血性心力衰竭大鼠心臟收縮舒張功能和減輕心肌組織損傷，但其作用機制尚不明確。

心臟損傷是一個多因素共同作用的復雜過程，其病理過程與細胞凋亡密切相關[13]。正常生理情況下，細胞凋亡一般在衰老或病變細胞中發生，是機體清除衰老或病變細胞，維持細胞動態平衡的自我保護機制；當機體受到外界凋亡刺激時，細胞失去對凋亡相關基因轉錄表達的控制，導致細胞凋亡出現異常，引起細胞壞死，進而引起機體發生病理性變化[14，15]。本研究發現，IHF大鼠凋亡心肌細胞比例及心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平均顯著高于對照組；GSPE作用4周后，IHF大鼠凋亡心肌細胞比例及心肌組織cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白水平明顯下降，提示GSPE可抑制缺血性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡。進一步檢測發現，細胞凋亡是生物體調節機體細胞平衡的一種自主死亡程序，研究表明MAPK信號通路與細胞凋亡密切相關。當機體受到外界刺激時，MAPK通路通過一系列級聯激活，可將胞外信號傳遞至細胞內，激活下游靶基因轉錄和表達，參與調控細胞凋亡、炎癥反應等多種生理過程[16]。據報道，三條MAPK信號通路并行存在于哺乳類動物細胞中，分別為細胞外信號調節激酶(Extracellular signal regulated protein kinase，ERK)、p38 MAPK和C-Jun N-末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)通路，當細胞接收到外界刺激信號時，可激活ERK、p38 MAPK、JNK信號通路中的部分或全部，既可獨立作用也可協調作用調節細胞功能[17，18]。多項研究證實，MAPK信號通路異常激活與心肌肥厚、急性心梗、心衰等多種心血管疾病的發生密切相關[19]。Cipolletta等[20]通過構建病理性心肌肥厚大鼠模型，發現ERK蛋白在模型大鼠心肌組織中高度磷酸化，抑制其磷酸化程度可有效降低模型大鼠心臟體積、減輕心臟質量和降低心肌壁厚度，減輕心肌肥厚病癥。本研究發現，IHF組大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平程度明顯高于對照組；GSPE作用4周后，IHF大鼠心肌組織ERK1/2、MAPK、JNK蛋白磷酸化程度降低，提示GSPE可抑制MAPK信號通路激活。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能通過調節MAPK通路抑制心肌細胞凋亡，為將葡萄籽原花青素應用于改善缺血性心力衰竭提供了一定理論基礎。