大鼠抗人β-catenin多克隆抗體的制備與鑒定①

牛夏憶 李 淼 張 倩 陳云雨 劉曉平

(皖南醫學院藥物篩選與評價研究所，蕪湖241002)

Wnt/β-catenin信號通路的異常活化在肝癌、乳腺癌、結直腸癌、急慢性淋巴細胞白血病、非小細胞肺癌等多種癌癥的發生與發展中發揮重要作用，已成為腫瘤靶向治療的重要靶標之一[1,2]。β-catenin是經典Wnt信號通路中重要的信號轉導效應分子，其核心功能區包括犰狳蛋白重復片段結構域(138-686 aa)蛋白和C端轉錄激活結構域(687-781 aa)，主要介導與Wnt信號通路其他蛋白相互作用和染色質重塑復合體的募集[3]。在腫瘤細胞內，β-catenin通過與Tcf4(T-cell factor 4)和Lef1(lymphoid enhancer factor 1)相互作用而啟動大量原癌基因表達，調控腫瘤細胞的生長、分化、增殖、浸潤及轉移[4,5]。另外，Spranger等研究發現腫瘤細胞內高表達β-catenin可能是黑色素瘤抵抗免疫治療的重要機制之一，但β-catenin如何在腫瘤微環境中調控免疫耐受的分子機制尚未明確[6,7]。

本實驗旨在利用DNA重組技術進行人β-catenin(138-781 aa)原核表達與分離純化，并以此為抗原制備特異性大鼠多克隆抗體(Polyclonal antibody,PcAb)，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質粒和pET-30a(+)載體由中國科學院大學存濟醫學院袁莉教授惠贈；E.coliDH5α及E.coliRosetta (DE3)感受態細胞、Taq酶、DNA標準分子量、pEASY?-T1試劑盒、T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白標準分子量、BamHⅠ與XhoⅠ購自全式金公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；氨芐西林、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)購自阿拉丁公司；牛血清白蛋白、小鼠抗組氨酸(Histidine,His)標簽單抗、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗小鼠IgG和HRP-山羊抗大鼠IgG購自Biosharp公司；MaxiLuminTM化學發光液購自百智生物公司；四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)溶液購自天根生化科技(北京)有限公司；384孔板購自PerkinElmer公司；異硫氰酸熒光素(Fluoresc-ence isothiocyanate,FITC)標記的Lef1[FITC-Lef1:FITCGDPELCATDEMIPFKDE]由上海強耀生物科技有限公司合成；HisTrapTM層析柱購自GE公司；Freund完全佐劑和Freund不完全佐劑購自Sigma公司；Wistar大鼠購自維通利華公司；其他生化試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 β-catenin(138-781 aa)基因克隆 根據人β-catenin(138-781 aa)基因序列設計引物，上游引物P1：5′-AGGATCCAACTTGATTAACTATCAA-3′；下游引物P2:5′-ACTCGAGCAGGTCAGTATCAAACCA-3′。以GST-β-catenin-pGEX-4T-1質粒為模板擴增β-catenin基因片段。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s、進行30個循環后，72℃總延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。

1.2.2 β-catenin原核表達載體構建 β-catenin基因進行切膠回收后，以pEASY?-T1試劑盒與T載體連接后，轉化E.coliDH5α感受態細胞，涂布于LB固體培養基(含100 μg/ml氨芐西林)。37℃培養過夜后，挑取經藍白斑篩選的單菌落進行PCR鑒定。將鑒定的陽性菌落進行測序和BLAST比對分析。

測序正確的克隆質粒和pET-30a(+)載體進行雙酶切反應，將回收的β-catenin基因片段與pET-30a(+)載體以T4DNA連接酶于16℃連接過夜，構建重組質粒β-catenin-pET-30a(+)。重組質粒轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，經卡那霉素抗性篩選后，挑取單菌落再次進行PCR鑒定和質粒雙酶切鑒定。

1.2.3 β-catenin原核表達 將重組質粒轉化E.coliRosetta (DE3)感受態細胞中，涂布LB固體培養基，37℃培養過夜。隨機挑取6個單菌落接種至5 ml LB液體培養基(含50 μg/ml卡那霉素)中，誘導β-catenin表達(1 mmol/L IPTG，37℃誘導6 h)，以8% SDS-PAGE檢測。以轉化pET-30a(+)質粒的E.coliRosetta (DE3)為陰性對照組。

1.2.4 β-catenin誘導溫度與誘導時間優化 將工程菌接種于5 ml LB液體培養基(含50 μg/ml卡那霉素)中，設置誘導溫度為30℃，以1.0 mmol/L IPTG分別誘導0、2、4、6、8、10、12 h。在各時間點等量收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件進行β-catenin表達量分析。將誘導溫度設置為25℃和20℃，重復上述操作。

1.2.5 β-catenin最佳表達條件確定 等量收集30℃誘導8 h、25℃誘導10 h和20℃誘導10 h的菌體，用適量TBS(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH8.0)重懸后以超聲波法裂解菌體。離心收集裂解后的上清液和沉淀，以8% SDS-PAGE分析β-catenin的可溶表達。

1.2.6 IPTG誘導濃度優化 工程菌分別以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG，25℃誘導10 h，等量收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析不同IPTG誘導濃度條件下β-catenin表達量。

1.2.7 β-catenin分離純化與鑒定 以確定的最佳表達條件進行工程菌大量培養，收集裂解菌體上清液，以25%飽和硫酸銨溶液沉淀后，用適量A液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑 pH7.8)稀釋制備粗提液。將HisTrapTM層析柱用10倍柱床體積的A液進行清洗平衡后，以0.5 ml/min流速上樣。最后以B液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L 咪唑 pH7.8)進行梯度洗脫并收集目的蛋白。純化的β-catenin蛋白以8% SDS-PAGE分析，經TBS(25 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl pH8.0)透析后，以BCA法定量。

將含有純化的β-catenin蛋白泳道的電泳膠轉膜，進行Western blot檢測。一抗為小鼠抗His標簽單抗(1∶2 000)，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，以MaxiLuminTM化學發光液顯影成像。

1.2.8 熒光偏振實驗 參考相關文獻[8,9]，將80 nmol/L FITC-Lef1(30 μl/孔)依次加入到384孔板中，同時將β-catenin蛋白以熒光偏振反應液(50 mmol/L Tris、10 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA pH8.0)稀釋至1 000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、0 nmol/L。將上述蛋白稀釋液以30 μl/孔依次加入到含有FITC-Lef1的384孔板中，每個濃度設置3組復孔。室溫避光15 min，多功能酶標儀檢測毫偏值(millipolarization unit,mP)。以GraphPad Prism軟件擬合結合曲線并計算結合反應的解離常數(Dissociation constant)即Kd值。

1.2.9 抗人β-catenin多克隆抗體的制備 采用參考文獻所述的方法[10]，用β-catenin蛋白作為免疫原，免疫原劑量為200 μg/(只·次)。首次免疫將抗原與等體積Freund完全佐劑充分混合乳化，大鼠皮下注射。間隔3周后進行第二次加強免疫，將抗原與等體積Freund不完全佐劑充分混合乳化，皮下注射。第二次免疫后的第7 d，大鼠尾尖采血，以ELISA法檢測抗血清效價。抗血清效價設定標準：抗血清效價≥1∶70 000。如達到效價，取全血分離血清備用。

1.2.10 抗人β-catenin多克隆抗體效價檢測 將β-catenin蛋白(10 μg/ml；100 μl/孔)包被96孔酶標板后，以10%牛血清白蛋白37℃封閉2 h。PBST洗板3次后，加入以2倍倍比稀釋的大鼠抗血清(1∶1 000～1∶1 024 000；100 μl/孔)，每組3個復孔，室溫孵育1 h，同時以動物免疫前血清作為陰性對照組。加入HRP-山羊抗大鼠IgG后，37℃孵育1 h。TMB溶液顯色后，以多功能酶標儀檢測OD450值。S/N=OD稀釋抗血清/OD陰性對照，陽性樣品判斷標準為S/N≥3.0。

1.2.11 抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性檢測 將含有β-catenin蛋白(0.5、1、2 μg)的電泳膠轉膜進行Western blot檢測。一抗為抗人β-catenin多克隆抗體(1∶10 000)，二抗為HRP-羊抗大鼠IgG(1∶5 000)，以MaxiLuminTM化學發光液顯影成像。將HeLa、A549、HepG2、HT29、MCF-7和MRC-5細胞裂解，同法檢測細胞裂解液中的內源β-catenin。

2 結果

2.1 β-catenin原核表達質粒構建 以GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質粒為模板，利用PCR反應擴增出約1 932 bp的特異片段，其與β-catenin基因片段理論大小一致(圖1A)。將β-catenin基因片段與pET-30a(+)載體連接構建重組質粒β-catenin-pET-30a(+)，隨機挑取經藍白斑篩選的單菌落進行PCR鑒定。電泳結果表明，所有菌落均可擴增出約1 932 bp的特異片段(圖1B)。重組質粒經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，再次得到了約1 932 bp的特異片段(圖1C)。上述結果表明，成功構建了β-catenin原核表達質粒。

2.2 β-catenin原核表達 6株工程菌以1 mmol/L IPTG于37℃誘導6 h后，等量收集的菌體進行8% SDS-PAGE分析β-catenin原核表達。實驗結果顯示，與陰性對照組相比，工程菌經IPTG誘導后，在分子量77 kD處有明顯的蛋白表達條帶，其與β-catenin理論分子量基本一致(圖2)。這表明成功進行了β-catenin原核表達。

圖1 β-catenin原核表達質粒的構建Fig.1 Construction of bacterial expression plasmid of human β-catenin proteinNote: A.PCR product of β-catenin gene；M.DNA marker；1.β-catenin gene product；B.PCR products of six random positive clones；M.DNA marker；1-6.β-catenin gene product from β-catenin-pET-30a(+)/E.coli DH5α；C.Dual-restriction enzyme digestion map for β-catenin-pET-30a(+) plasmid；M.DNA marker；1.β-catenin gene product digested with BamHⅠ/XhoⅠ.

圖2 β-catenin原核表達Fig.2 Bacterial expression of human β-catenin proteinNote: 1.Negative control；M.Protein marker；2-7.Positive clones.

2.3 β-catenin誘導溫度與誘導時間優化 工程菌經不同誘導溫度和誘導時間培養后，離心收集等量菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析β-catenin表達量。實驗結果表明，誘導溫度為30℃時，最佳誘導時間為8 h，此時β-catenin表達量約為12.96%并趨于穩定(圖3A)；誘導溫度為25℃時，最佳誘導時間為10 h，此時β-catenin表達量約為12.83%并趨于穩定(圖3B)；誘導溫度為20℃時，最佳誘導時間為12 h，此時β-catenin表達量約為12.23%并趨于穩定(圖3C)。

圖3 β-catenin誘導溫度與誘導時間優化Fig.3 Determination of an optimal temperature and dur-ation of induction for human β-catenin protein expressionNote: A,B,C.SDS-PAGE analysis of human β-catenin protein bacterial expression at 30℃ (A),25℃ (B) and 20℃ (C) for 0-12 h；1.Negative control；M.Protein marker；2-8.Total cell proteins (TCP),0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h.

圖4 β-catenin最佳表達條件確定Fig.4 Determination of an optimal culture condition for human β-catenin protein expression Note: M.Protein marker；1.TCP (30℃)；2.Supernatant (30℃)；3.Pellet (30℃)；4.TCP (25℃)；5.Supernatant (25℃)；6.Pellet (25℃)；7.TCP (20℃)；8.Supernatant (20℃)；9.Pellet (20℃).

2.4 β-catenin最佳表達條件確定 等量收集30℃誘導8 h、25℃誘導10 h和20℃誘導12 h的菌體，將菌體以超聲波法裂解后，上清液和沉淀以8% SDS-PAGE分析。實驗結果表明，30℃誘導8 h時，β-catenin大部分以包涵體形式表達，上清液中的目的蛋白含量較少；25℃誘導10 h和20℃誘導12 h時，上清液中β-catenin表達量明顯增多，沉淀中目的蛋白含量減少，β-catenin基本以可溶形式表達(圖4)。

2.5 最佳IPTG誘導濃度確定 工程菌以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG于25℃誘導10 h，等量收集菌體以8% SDS-PAGE分析。實驗結果表明，隨著IPTG誘導濃度的逐漸增加，β-catenin表達量基本維持在12%左右并趨于穩定，IPTG誘導濃度對β-catenin表達量影響較小(圖5)。

綜上所述，確定β-catenin最佳表達條件為0.2 mmol/L IPTG誘導濃度，25℃誘導10 h。

2.6 β-catenin分離純化與鑒定 工程菌以確定的最佳表達條件進行大量培養，菌體裂解上清液以25%飽和硫酸銨溶液沉淀后制備粗提液，經HisTrapTM層析柱分離純化后，收集的樣品以8% SDS-PAGE進行分析。實驗結果顯示，在分子量77 kD處獲得了純度較高的β-catenin蛋白(圖6A)。用抗His標簽抗體進行Western blot分析，結果表明可在相同分子量位置顯現特異條帶，證實了β-catenin的正確表達(圖6B)。純化的β-catenin蛋白經TBS透析和BCA法定量后，其濃度為1.2 mg/ml。

2.7 β-catenin生物學活性鑒定 細胞核內β-catenin/Lef1相互作用是Wnt/β-catenin信號通路中最重要的轉錄調控方式[1,5]。根據參考文獻[11]，將FITC-Lef1探針作為轉錄因子Lef1的模擬物，以熒光偏振實驗檢測β-catenin與探針的相互作用。實驗結果表明，隨著β-catenin蛋白濃度的不斷升高，mP值也逐漸升高并趨于穩定，結合反應具有明顯的量效關系，Kd值約為66.5 nmol/L(圖7)，這表明β-catenin蛋白具有良好的生物學活性。

圖5 β-catenin最佳IPTG誘導濃度確定Fig.5 Determination of an optimal IPTG concentration for human β-catenin protein expressionNote: M.Protein marker；1.0 mmol/L IPTG；2.0.2 mmol/L IPTG；3.0.4 mmol/L IPTG；4.0.6 mmol/L IPTG；5.0.8 mmol/L IPTG；6.1.0 mmol/L IPTG.

2.8 抗人β-catenin多克隆抗體效價測定 用β-catenin蛋白包被酶標板，ELISA方法檢測抗人β-catenin多克隆抗體效價，以大于陰性血清OD450值3倍的最小稀釋倍數值作為多克隆抗體的效價。檢測結果表明，純化的β-catenin蛋白具有良好的免疫原性，制備的抗人β-catenin多克隆抗體效價為 1∶128 000(圖8)。

圖6 β-catenin分離純化與鑒定Fig.6 Purification and identification of human β-cate-nin proteinNote: A.Purification of human β-catenin protein；M.Protein marker；1.Precipitated human β-catenin protein by 25% saturated ammonium sulfate solution；2-5.Purified human β-catenin protein；B.Identification of human β-catenin protein by Western blot assay；1.Protein marker；2.Human β-catenin protein band (77 kD).

圖7 β-catenin生物學活性鑒定Fig.7 Biological activity analysis of purified β-cateninprotein

2.9 抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性測定 將抗人β-catenin多克隆抗體(1∶10 000)作為一抗，分別與β-catenin蛋白和細胞內源β-catenin反應，以Western blot實驗檢測其抗原特異性。實驗結果表明，不同劑量的β-catenin蛋白與多抗孵育后，在分子量77 kD左右均顯現特異條帶，隨著β-catenin劑量的增多，特異條帶逐漸增粗(圖9A)；6株細胞裂解液在分子量86 kD位置也呈現出特異條帶(圖9B)。上述結果說明，抗人β-catenin多克隆抗體具有良好的抗原特異性，均能與β-catenin蛋白和細胞內源β-catenin特異結合。

圖8 ELISA檢測抗人β-catenin多克隆抗體效價Fig.8 Analysis of anti-β-catenin polyclonal antibody titer using ELISA

圖9 Western blot實驗鑒定抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性Fig.9 Analysis of immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody by Western blot assayNote: A.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against recombinant β-catenin protein by Western blot assay；1.0.5 μg β-catenin protein；2.1 μg β-catenin protein；3.2 μg β-catenin protein；B.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against endogenous β-catenin protein in cancer and normal cells by Western blot assay；1.HeLa cell；2.A549 cell；3.HepG2 cell；4.HT29 cell；5.MCF-7 cell；6.MRC-5 cell.GAPDH was used as the loading control.

3 討論

β-catenin介導的轉錄調控(β-catenin responsive transcription,CRT)作為Wnt/β-catenin信號通路的核心調控方式，廣泛參與腫瘤細胞的生長、分化、浸潤、轉移與腫瘤干細胞休眠體形成，促進腫瘤耐藥與復發，已成為新型高選擇性抗腫瘤藥物開發的理想靶標之一[1,2,4,5]。深入研究β-catenin在Wnt信號通路中的調控功能，尤其是調控腫瘤免疫耐受的分子機制研究，對未來腫瘤免疫治療具有重要意義[7]。抗體是蛋白功能研究的重要工具，但目前針對抗人β-catenin多克隆抗體制備國內還未有相關報道。特異性抗人β-catenin多克隆抗體制備對深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的生物學功能具有重要意義。

多克隆抗體制備具有操作簡單、制備周期短和特異性高等諸多優點，已成為抗體制備的重要方法。很多研究者采用大腸桿菌原核表達重組蛋白，將其作為抗原免疫大鼠、小鼠或新西蘭白兔后成功制備了多種高特異性多克隆抗體用于蛋白功能研究[10,12-15]。由于His標簽分子量較小，幾乎不影響目的蛋白的理化性質，且方便重組蛋白的純化和檢測[16,17]，故此本研究采用pET-30a(+)載體的His標簽融合表達策略進行了人β-catenin核心功能結構域(138-781 aa)的原核表達。與已報道的GST-β-catenin-His雙標簽融合表達策略相比[18,19]，本研究建立的人β-catenin原核表達策略具有更好的簡便性、實用性和經濟性。

鑒于誘導溫度和誘導時間是影響外源基因在大腸桿菌系統表達的重要因素[20]，我們通過原核表達優化以提高目的蛋白表達量和促進可溶表達。β-catenin原核表達優化實驗結果表明，誘導溫度和時間對β-catenin的表達量有重要影響。30℃誘導8 h時，β-catenin易于形成包涵體；25℃和20℃低溫誘導過夜則使β-catenin包涵體量減少，促進了其可溶表達，這可能與低溫可減慢蛋白的表達速率并有利于蛋白質正確折疊有關[20]。另外，我們發現IPTG誘導濃度對β-catenin表達量影響不大，低濃度的IPTG即可誘導β-catenin大量表達。

熒光偏振技術(Fluorescence polarization,FP)主要基于偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關的檢測原理，被廣泛應用于藥物篩選、疾病診斷及大分子活性鑒定[8,9,21,22]。我們以FITC-Lef1探針作為轉錄因子Lef1的模擬物，應用FP實驗證實了β-catenin蛋白能與FITC-Lef1特異結合，Kd值約為66.5 nmol/L。這表明制備的β-catenin蛋白具有良好的生物學活性。

利用純化的β-catenin蛋白作為抗原免疫大鼠制備多克隆抗體，以ELISA實驗和Western blot實驗進行了抗體效價和抗原特異性檢測。ELISA實驗表明，制備的抗人β-catenin多克隆抗體效價可達1∶128 000。Western blot實驗顯示多抗不僅能特異識別β-catenin重組蛋白，還能與細胞內源β-catenin特異結合，這表明制備的抗人β-catenin多克隆抗體具有良好的抗原特異性。另外，我們發現β-catenin蛋白在大部分腫瘤細胞中呈高水平表達，在正常細胞中則呈低水平表達。

綜上所述，本實驗成功進行了人β-catenin蛋白原核表達優化、特異性多克隆抗體的制備與鑒定，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的生物學功能奠定了實驗基礎。

致謝：衷心感謝中國科學院大學存濟醫學院袁莉教授和中國醫學科學院-北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室李霓副研究員在β-catenin原核表達方面給予的悉心指導和無私幫助！