萍鄉(xiāng)地區(qū)高危型人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)及感染情況分析

任 妹 何 雯 蔡麗娟 黃永建

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，萍鄉(xiāng)337000)

宮頸癌作為婦女中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)排名第二，僅次于乳腺癌，近年來(lái)的發(fā)病率不降反增，更加趨于年輕化[1]。宮頸癌的發(fā)生是由多種因素共同影響導(dǎo)致的結(jié)果，而大量研究表明，其主要因素是宮頸人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的持續(xù)性感染[2]。HPV的篩查是預(yù)防宮頸癌的一項(xiàng)重要措施，也是診斷宮頸早期病變的重要手段。目前對(duì)于HPV的感染還沒(méi)有明確有效的治療方法，主要依賴于HPV疫苗預(yù)防接種。多項(xiàng)研究表明[3]，HPV感染具有較大的地區(qū)差異性，不同國(guó)家之間、不同地區(qū)之間在HPV感染類型、多重感染情況等多方面都存在著不同程度的差異。本研究通過(guò)收集萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院2017年1月～12月HPV分型檢測(cè)的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析HPV感染陽(yáng)性率和亞型分布情況，以及HPV感染與年齡、就診途經(jīng)的相關(guān)性，為臨床診斷、治療及預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月～12月在萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院門(mén)診、體檢和住院行HPV分型檢測(cè)的3 797例女性患者宮頸拭子，年齡范圍17～82歲，平均年齡(42.9±11.4)歲，按不同年齡段分為5個(gè)組，其中<30歲者366例，30～39歲者1 055例，40～49歲者1 510例，50～59歲者619例，≥60歲者247例。

1.1.2 試劑與器材 PCR擴(kuò)增儀(上海之江生物)、高速低溫離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)、八聯(lián)管微量離心機(jī)(珠海黑馬)、干式恒溫器(杭州奧盛)、漩渦振蕩器(海門(mén)其林貝爾)、生物安全柜(北京阿爾泰)。

1.2 方法

1.2.1 HPV核酸分型測(cè)定 實(shí)驗(yàn)使用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒高危型分型核酸測(cè)定試劑盒，采用15種高危型HPV型別(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)的特異性引物及熒光探針，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合Taqman技術(shù)，對(duì)15種HPV亞型的特異性DNA核酸片段進(jìn)行分型定性檢測(cè)。

1.2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增 將配制好的試劑以每份36 μl分裝于薄壁PCR反應(yīng)管中，然后將標(biāo)本和陰陽(yáng)對(duì)照處理后所得反應(yīng)模板各4 μl分別加入薄壁PCR反應(yīng)管，反應(yīng)體系共40 μl。加樣完成后立即將反應(yīng)管置于熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 2 min，再按93℃ 10 s→ 62℃ 31 s循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測(cè)在62℃進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV總體感染和亞型分布情況 本研究對(duì)3 797例宮頸脫落細(xì)胞樣本的基因分型結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯示，HPV陽(yáng)性標(biāo)本786例，陰性標(biāo)本3 011例，總陽(yáng)性率為20.70%(786/3 797)。786份陽(yáng)性樣本中，15種HPV亞型累計(jì)標(biāo)本頻次為992次，15種基因型均有檢出，其中HPV52亞型陽(yáng)性率達(dá)6.82%，占所有亞型陽(yáng)性率的構(gòu)成比為26.11%；其次為HPV58、HPV16、HPV39、HPV18和HPV51，占比分別為15.12%、14.52%、8.47%、6.75%、6.75%。HPV45型感染例數(shù)最低為13例，陽(yáng)性率0.34%，占1.31%。各亞型檢出率詳見(jiàn)圖1。

2.2 不同年齡段HPV的感染情況 將研究對(duì)象按年齡從小到大排序進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，50～59歲年齡段陽(yáng)性率最高，為26.98%，其次為≥60歲和<30歲年齡段，經(jīng)多組間χ2檢驗(yàn)顯示，各年齡組間的HPV感染情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.894，P<0.05)。HPV52、58、16型在各年齡階段感染率均占據(jù)前三位，在具體型別中，只有HPV16、18、56和58四種亞型的感染在不同年齡段間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他亞型在各年齡段中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果詳見(jiàn)表 2、3。

2.3 HPV單一型和多重感染情況 786例陽(yáng)性標(biāo)本中，單一亞型感染患者有628例，占全部陽(yáng)性患者的79.9%(628/786)，其中以HPV52、HPV58、HPV16占絕大多數(shù)；多重感染患者共158例，占全部陽(yáng)性患者的20.1%(158/786)；多重感染中二重感染為主，占全部多重感染的79.11%(125/158)。 單一感染、雙重感染和三重感染都為40～49歲組分布最多。單一感染所占比最高在30～39歲年齡段(83.92%)，多重感染占比最高在<30歲年齡段，多重感染占比最低在30～39歲年齡段(16.08%)，而隨著年齡的增長(zhǎng)，多重感染占比呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在多重感染中，絕大多數(shù)為HPV52型合并的多重感染，有78例，占全部多重感染的49.79%，與各亞型陽(yáng)性率結(jié)果大致一致。詳見(jiàn)表4、圖2、3。

圖1 高危型HPV亞型陽(yáng)性率(%)Fig.1 Positive rate of high-risk HPV subtypes(%)

表2 不同年齡段高危型HPV感染情況

Tab.2 High-risk HPV infection in different age groups

Age(year)NumberPositive casePositive rate(%)<303667921.5830-391 05519918.8640-491 51028018.5450-5961916726.98≥602476124.70Total3 79778620.70

表3 各年齡組15種高危HPV亞型感染情況

Tab.3 Infection status of 15 high-risk HPV subtypes in each age groups

HPV subtypeAge(year)<30(n=366)30-39(n=1 055)40-49(n=1 510)50-59(n=619)≥60(n=247)χ2PHPV5222709356186.3860.172hPV58153250391414.9160.005HPV16133346312121.161<0.001HPV391026301261.3910.846HPV189131818915.4090.004HPV51721211533.5550.471HPV3345141238.6780.070HPV5961013712.8740.579HPV666511635.3950.249HPV568676212.4420.014HPV312410345.3680.252HPV681511025.3950.203HPV823110206.7750.103HPV35167101.9160.749HPV45251416.0600.195Total791992801676123.89<0.001

Note：There are multiple infections,and the samples of each subtype of infection are not counted repeatedly.

表4 不同年齡組高危HPV亞型單一感染及多重感染情況

Tab.4 Single and multiple infections of high-risk HPV subtypes in different age groups

Age(year)Infection typeSingle infectionThe dual infectionTriple infectionFour heavy infectionFive heavy infectionMore than five heavy<305619211030-3916727401040-4922645720050-59132275120≥604774300Total628(79.0%)125(15.9%)22(2.8%)7(0.89%)4(0.51%)0(0.0%)

圖3 不同年齡組高危HPV亞型單一感染和多重感染構(gòu)成比Fig.3 Ratio of single and multiple infections of high-risk HPV subtypes in different age groups

表5 不同就診途徑患者高危HPV感染情況

Tab.5 High-risk HPV infection in patients with different treatment approaches

ClinictypenPositivecaseNegativecasePositive rate(%)Outpatient3 4047072 67920.77Hospitalization3466729719.36Physical exam47123525.53Total3 7977863 01120.70

2.4 不同就診途徑女性HPV的感染情況 門(mén)診患者共3 404例，陽(yáng)性707例(20.77%)；住院患者共346例，陽(yáng)性患者67例(19.36%)；體檢患者共47例，陽(yáng)性患者12例(25.53%)。體檢組的陽(yáng)性率最高，住院組的陽(yáng)性率最低，經(jīng)多組間χ2檢驗(yàn)顯示，不同就診途徑間的HPV感染情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.902，P>0.05)。各組感染情況詳見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 HPV與宮頸癌 HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)、宮頸癌(Cervical cancer，CC)、食管癌、肛管癌等多種病癥有著密切的聯(lián)系，其中與宮頸癌的關(guān)系最為密切[4]。目前已知的有200多種亞型，根據(jù)其致病性的強(qiáng)弱，可分為高危型(HR-HPV)和低危型(LR-HPV)，高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59等型，與食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是高度宮頸上皮內(nèi)病變(CINⅡ、CINⅢ)的致病因素；低危型包括6、11、42、43等型，主要與外生殖器尖銳濕疣、扁平疣和低級(jí)別的子宮頸上皮內(nèi)病變(CINⅠ)相關(guān)，不發(fā)生惡性病變[5]。關(guān)于HPV感染與宮頸疾病進(jìn)展的相關(guān)性的研究顯示，高危型HPV的感染率越高，宮頸病變程度越嚴(yán)重[6]；因此，HPV的篩查對(duì)于宮頸癌的防治起到了十分重要的作用，特別是高危型HPV的檢測(cè)，是篩查宮頸病變以及判斷宮頸病變程度的重要手段。

3.2 HPV的感染率與亞型分布情況 HPV的感染具有很強(qiáng)的地域差異，其發(fā)病率在全世界各個(gè)地域都有所不同，美國(guó)女性HPV感染率為39.9%，其中高危型感染率20.4%[7]；孟加拉國(guó)的HPV感染率為21.1%[8]。而在同一地域隨著時(shí)間的遷移感染率也隨之發(fā)生不同程度的變化，Wu等[9]在2013年報(bào)道中國(guó)女性的HPV感染率為14.3%，Wu等[10]在2017年報(bào)道為22.7%。本研究陽(yáng)性檢出率為20.7%，結(jié)果低于Wu等[10]報(bào)道的中國(guó)女性HPV感染率(22.7%)，與杭州地區(qū)近幾年綜合感染率(20.54%)接近[11]。關(guān)于HPV的流行病學(xué)調(diào)查研究表明，HPV的亞型分布在不同地域存在明顯的差異[12]。HPV16是在世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的亞型[13]，其次為HPV18型。研究統(tǒng)計(jì)顯示，北美洲HPV感染前五位為HPV16、53、52、18和39，歐洲為HPV16、18、31、33和58，亞洲為HPV16、52、58、18和56[14]。中國(guó)總體易感的HPV亞型主要為HPV16、18、58、33、52等型，其中HPV16為最主要亞型，18和58型分居二、三位[15]。上海地區(qū)HPV感染居前五位的是HPV16、52、58、53和33[16]；深圳福田區(qū)高危型HPV中感染前五名分別為HPV52、16、58、39和51型[17]，其中52型感染率顯著高于其他亞型，16與58型之間差距較小位于二、三位。本研究15種高危型HPV亞型全部檢出，結(jié)果顯示主要感染的HPV型別依次為HPV52型(6.82%)，HPV58型(3.95%)、HPV16型(3.79%)、HPV39型(8.47%)、HPV18型和HPV51型(6.75%)，結(jié)果與深圳福田區(qū)的感染情況相似[17]，與早期Bao等[18]報(bào)道的中國(guó)女性首選HPV型為HPV52和58 型這一結(jié)論相一致。在本研究中，HPV16不是最主要感染型別，這與其他地區(qū)的分布情況有所區(qū)別，其中的原因可能是地域或種族的差異，與城市的經(jīng)濟(jì)水平相關(guān)。

3.3 HPV多重感染情況 HPV的多重感染是指?jìng)€(gè)體感染兩種或兩種以上亞型的HPV的情況，本研究中感染總體以單一感染為主，占全部HPV陽(yáng)性者的79.9%(628/786)，各年齡段中也為單一感染占絕大部分比例，這與相關(guān)研究報(bào)道的HPV感染的主要形式為單一感染的結(jié)論相一致[19]。在多重感染中，出現(xiàn)最多次數(shù)的是HPV52型，其次依次是HPV58合并的多重感染。成帆等[20]針對(duì)HPV多重感染進(jìn)行了專門(mén)的多組別分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV16和18兩種亞型具有較高和其他亞型合并感染的機(jī)會(huì)，且多重感染中高危型HPV更加常見(jiàn)；另有文獻(xiàn)報(bào)道HPV31、33、35和52型與HPV16有一定的相關(guān)性[21]，HPV39、45、59和68型與HPV18更有關(guān)聯(lián)，不同研究顯示不同的分析結(jié)果，但形成這些結(jié)果的原因究竟是HPV自身的生物學(xué)因素，還是宿主的生物學(xué)因素，還有待專家學(xué)者們研究。

3.4 HPV感染與年齡的關(guān)系 年齡是感染HPV的一個(gè)重要的因素，文獻(xiàn)表明，HPV的感染存在兩個(gè)年齡段高峰，<30歲的年輕女性HPV感染率較高[14，22]，最主要的原因是該年齡段性行為頻繁，且缺乏與性行為相關(guān)的衛(wèi)生知識(shí)，其次為該年齡段女性的免疫系統(tǒng)對(duì)HPV不敏感，容易造成HPV的感染，但更多的是一過(guò)性的感染[23]。隨著年齡的增高，感染率隨之下降，但隨著時(shí)間的積累，由于生育、流產(chǎn)和性行為等造成的機(jī)械性刺激或損傷，以及絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素分泌降低，免疫功能降低等原因，導(dǎo)致HPV的反復(fù)和持續(xù)感染增加，于是形成第二個(gè)感染高峰。研究顯示不同地區(qū)的年齡分布情況存在差異，杭州地區(qū)HPV感染的年齡分布為15～24歲和>54歲兩個(gè)高峰，其中15～24歲感染率最高[14]；河北地區(qū)HPV陽(yáng)性率為≤30歲年齡段最高，其次為>50歲年齡段，30～40歲年齡段最低[24]。本研究感染高峰年齡在50～59歲之間，其次為≥60歲和<30歲，整體呈兩端較高而中間較低的U型分布，也可以說(shuō)50歲以上和30歲以下兩個(gè)年齡段女性是HPV感染高危人群。本研究與杭州、河北地區(qū)感染情況相似。對(duì)于50歲以上的女性人群，由于病毒的持續(xù)和反復(fù)感染，更應(yīng)該加大篩查力度，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。此外，該研究中有8例20歲以下女性，HPV陽(yáng)性者3例，此年齡段女性在心理上較不成熟，自身的防護(hù)意識(shí)較弱以及缺乏生理衛(wèi)生知識(shí)[25]，這是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題，因此，社會(huì)對(duì)青少年的生理健康教育工作應(yīng)該加以重視。

3.5 不同就診途徑HPV感染情況 目前關(guān)于不同就診途徑的分析在全國(guó)范圍內(nèi)研究報(bào)道較少，王京偉等[26]對(duì)湖北地區(qū)的研究顯示，低危型HPV組中體檢組明顯高于其他兩組，高危型HPV組中門(mén)診組和住院組明顯高于體檢組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本研究中對(duì)象包括3 404例門(mén)診患者、346例住院患者和47例體檢患者，陽(yáng)性檢出率分別為20.77%、19.36%和25.53%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.902，P>0.05)，結(jié)果與王京偉的結(jié)果不相符，分析本研究中門(mén)診、住院和體檢患者的人數(shù)相差懸殊，是由于患者檢查通常都是先在門(mén)診掛號(hào)檢查，且只有一部分有嚴(yán)重宮頸病癥的患者才會(huì)住院治療，另一方面，體檢人員沒(méi)有主動(dòng)進(jìn)行HPV分型檢測(cè)的意識(shí)，其中可能也存在HPV與宮頸病變相關(guān)宣傳教育工作的力度還需加強(qiáng)的原因，使得該項(xiàng)目體檢人數(shù)較少，究竟不同就診途徑的HPV感染情況是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還需要更多的研究。

本研究結(jié)果顯示萍鄉(xiāng)地區(qū)高危型HPV感染陽(yáng)性率為20.7%，以單一感染為主，感染型別主要為HPV52、HPV58、HPV16、HPV39、HPV18和HPV51型，HPV16不是最主要亞型，HPV52和58比HPV16在該地區(qū)更加常見(jiàn)，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)HPV52和58型的重視，提倡包含HPV52和58型的HPV疫苗的生產(chǎn)和在該地區(qū)的應(yīng)用，使該地區(qū)HPV得到有效控制；本研究結(jié)果顯示各年齡段中HPV感染情況不同，50～59歲感染率最高，其次為≥60歲和<30歲，各年齡組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明50歲以上和30歲以下女性是該地區(qū)HPV的易感人群，在宮頸癌的篩查和預(yù)防時(shí)應(yīng)更加關(guān)注這兩個(gè)年齡段，建議加大關(guān)于HPV感染與宮頸癌的宣傳教育，鼓勵(lì)女性盡早并定期進(jìn)行HPV篩查檢測(cè)，以便更早更快的發(fā)現(xiàn)和治療宮頸疾病，防止宮頸癌的發(fā)生。