植物多糖的分離純化及抗腫瘤作用研究進展

范媛媛 左紹遠

摘要 多糖的分離純化是多糖研究的重要組成部分，多糖具有多種生物學活性，其中抗腫瘤是多糖的主要活性之一。多糖抗腫瘤機制大多與其免疫調節作用相關，通過總結相關文獻，綜述了近幾年多糖的提純方法、抗腫瘤活性及其作用機制。

關鍵詞 多糖；分離純化；抗腫瘤；免疫調節

中圖分類號 Q946.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0023-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.007

Abstract The extraction and purification of polysaccharides is an important part of polysaccharide research.

Polysaccharides have many biological activities， among which antitumor is one of the main activities of polysaccharides.

The antitumor mechanism of polysacchrides is mostly related to immune regulation.

The purification methods， antitumor activity and mechanism of polysaccharides in recent years were reviewed by summing up the literature.

Key words Polysaccharide；Separation and purification；Antitumor；Immune regulation

多糖廣泛存在于動物、植物及微生物的細胞壁中，常由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而形成高分子聚合物。多糖不僅是組織細胞的重要組成成分，其在細胞識別、細胞信號轉導、細胞間物質運輸、細胞分化、凋亡等過程中均發揮重要作用。研究表明，不同來源的多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物學活性。其中抗腫瘤活性是多糖的主要活性之一，也是近幾年多糖研究領域的前沿問題。筆者通過總結近幾年的相關文獻，對多糖的提純方法、抗腫瘤作用進行綜述。

1 多糖的提取

多糖的提取方法有多種，主要有水提法、酶提法、超聲波提取法、微波輔助提取法等，可根據不同的原料來源選擇合適的方法。

1.1 水提法

多糖大都溶于水，且隨著溫度的提高提取效率也提高[1]，但水溫一般應控制在80℃以下，否則會導致糖苷鍵的斷裂而破壞多糖的結構。水提法操作流程不復雜，成本較低，通?？色@得較滿意的提取效率，因此，目前熱水浸提法在多糖分離提取中得到廣泛應用。

左紹遠等[2]在研究紅花蜂花粉多糖時用水提醇沉法提取多糖，經苯酚-硫酸法測定多糖含量為86.12%，多糖提取率為2.85%。羅永會等[3]用水提法對慈姑進行提取多糖，最佳工藝條件：提取時間3 h，溫度70 ℃，料水比1∶15，提取2次，多糖提取率達12.94%。曾婷等[4]應用熱水浸提法提取仙茅粗多糖。仙茅干粉經乙醇脫脂處理后，加入35倍的蒸餾水煮沸水浴2.5 h，提取液進行抽濾，殘渣再重復以上步驟提取2次，濾液合并用95%乙醇沉淀過夜，65 ℃真空干燥得到仙茅粗多糖，采用硫酸-苯酚法測定仙茅多糖質量分數為91.8%。

1.2 酶提法

酶法提取多糖可分為單一酶提取法和復合酶提取法。吳素萍等[5]采用纖維素酶提取枸杞多糖，通過正交試驗對酶解pH、酶解溫度、酶解時間、加酶量4種影響因素進行研究，得到提取枸杞多糖的最佳工藝條件為加水量50 mL、pH 5.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間60 min、加酶量05%。在該條件下多糖得率為11.2%，而采用水提法多糖得率為81%。于翠芳等[6]采用復合酶提取法在單因素基礎上進行3因素3水平的Box-Dehnken中心組合試驗設計，得出復合酶提取法的最佳工藝，多糖得率為13.96%，與單一酶相比，在多糖得率上并無明顯優勢，但其時間比單一酶縮短50%。滕利榮等[7]研究了熱水提法和復合酶提法的最佳條件，用纖維素酶、果膠酶、胰酶3種酶按比例加入百合塊莖干品中，選取pH、酶促反應溫度和時間3個影響因素進行正交試驗，在最適條件下，多糖提取率為31.03%，是熱水提法的285倍，且還對2種不同方法得到的多糖抗氧化活性進行比較，酶法提取的多糖對O2-的清除率和對OH-的抑制作用均明顯高于水提法得到的多糖。

1.3 超聲波提取法

胡斌杰等[8]在提取靈芝多糖中應用了超聲波法，將靈芝菌粉按一定條件（料液比、時間、溫度、粒度）超聲提取2次，過濾，濾液合并，醇沉，用苯酚-硫酸法測定多糖含量，在超聲波法提取溫度50 ℃、時間20 min、粒度40目，傳統熱水提法提取溫度80 ℃、時間1.5 h、粒度40目的條件下，超聲法提取率較熱水提取法提高了30%以上，而時間縮短了近75%。超聲法溫度適中，避免了高溫有可能對多糖有效成分的破壞，從而使多糖的生物活性得以保持。雖然超聲波提取法的提取率率優于水提法，但超聲提取時間>20 min時，多糖的提取率會逐漸下降，可能是由于超聲波較長時間的機械剪切使多糖降解而導致[9]。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取是一種利用微波能量來提取多糖的新技術，與超聲的作用原理相似。聶金媛等[10]采用微波輔助提取法提取茯苓多糖，選擇微波作用時間、占空比、固液比3個因素，每個因素確定15個水平，以U15均勻設計表進行試驗，得出最佳提取工藝：微波作用時間18 min，占空比42%，固液比1∶50。在此條件下，茯苓多糖提取率為2.792%，相比水提法的多糖得率高1.35%。王麗等[11]采用微波法處理米糠多糖，通過單因素和正交試驗最終得出微波輔助提取米糠多糖的最優工藝條件為料液比1∶10；微波輻射時間2 min；微波功率400 W，多糖提取率為276%，高于傳統水提多糖得率2.02%。黃璞等[12]為優化黑靈芝孢子粉多糖的微波提取工藝，在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法和Box-Behnken 中心組合設計的方法，研究提取溫度、提取時間以及水料比3個自變量及其交互作用對多糖提取率的影響。利用SAS和響應面分析相結合的方法，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，并確定微波提取多糖最佳條件：溫度 129 ℃、時間 27 min、水料比為 31∶1。在此條件下，多糖提取率理論值為2.73%，實際值為2.64%，誤差較小。試驗證明，微波輔助提取法提取效率高，試驗時間短，可供選擇的溶劑較多，溶劑用量少，節能。此外，由于微波作用時間短，可有效避免長時間高溫操作對樣品造成的損壞，有利于熱不穩定多糖的提取[13]。

2 多糖的分離純化

多糖的粗提物通常為糖蛋白，且常含有色素及小分子雜質等，需進行脫蛋白、脫色及透析去除小分子雜質，可得總多糖?？偠嗵峭ǔＪ嵌喾N不同級分多糖的混合物，常需進一步分離分級、純化，以便獲得均一的多糖組分。劉紅梅等[14]在北極海參多糖的分離純化及抗腫瘤活性研究中發現，3種精制多糖對4種腫瘤細胞的抑制作用明顯強于總多糖，提示多糖的均一性與活性密切相關。

2.1 脫蛋白、脫色

多糖的提純方法有多種，脫蛋白常用的方法有Sevage法、酶法、三氟三氯乙烷法、沉淀法、硫酸銨法等。去除色素的方法有活性炭吸附、濾膜超濾、過氧化氫法、離子交換樹脂法、反膠束法等。

Sevage法是最常用的方法之一。Sevage法去除蛋白是根據蛋白質在氯仿等有機溶劑變性而不溶于水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇或正丁醇按比例調成混合物振蕩，蛋白質與氯仿-戊醇（正丁醇）生成凝膠物而分離的原理，以去除水層和溶劑層交界處的變性蛋白。程軒軒等[15]采用水提醇沉法提取白簕多糖，取白簕多糖水溶液，按4倍體積加入正丁醇-氯仿（1∶4）混合液振蕩離心取上層溶液，經6次脫蛋白過程后得到蛋白脫出率/多糖保留率分別為31.84%/9544%、34.08%/93.61%、39.66%/89.14%、78.21%/8457%、79.33%/78.28%、79.33%/77.27%。Sevage法脫蛋白較溫和，可避免多糖降解，但脫蛋白效率不高，且多糖保留率隨脫蛋白次數增加而減少。常與酶法脫蛋白結合，可提高脫蛋白效率。

色素分為脂溶性和水溶性，脂溶性色素可在提取多糖前對原料進行石油醚、乙醇回流，大部分脂溶性色素可去除。水溶性色素極易溶于水和乙醇，在醇沉步驟將其去除[16]。對殘留的色素可用透析、活性炭吸附等方法去除，熊偉等[16]采用活性炭吸附方法對螺旋藻粗多糖進行脫色處理，由于活性炭是具有多空結構的物質，因此能吸附多糖水溶液中的色素。

2.2 柱層析法

柱層析法作為常用提純方法之一，在分級純化多糖時應用廣泛。曹永強等[17]采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱純化植物乳桿菌胞外粗多糖，透析、冷凍干燥后得到SKT109胞外中性多糖和YW11胞外酸性多糖樣品，2種樣品經過DEAE-Sepharose FastFlow離子交換柱層析，有可能會含有相同電荷的不同組分，再經Sepharose CL-6B凝膠柱純化，經純化后的2種多糖純品的總多糖含量達92.31%、89.02%，純度較高。呂樂等[18]為研究葡萄樹傷流液多糖的抗氧化能力，采用DEAE-52纖維素柱對吐魯番無核白和喀什木納格葡萄樹傷流液中多糖進行分離純化，得到8個均一多糖組分。

3 多糖抗腫瘤作用

惡性腫瘤一直是危害人身健康的重要疾病之一。目前腫瘤的治療常采取手術及放化療。但放化療存在較嚴重的免疫抑制和造血抑制的毒副作用。而多糖可抑制腫瘤生長且毒副作用小，具有較好的臨床實際應用價值。

3.1 多糖的免疫調節作用

體內眾多的免疫系統起著抗腫瘤的作用，而多糖則是一種免疫增強劑，不但能激活T細胞、B細胞、M 、NK細胞、CTL細胞、LAK細胞等免疫細胞的活性，激活網狀內皮系統（RES）吞噬、清除老化細胞和異物以及病原體的作用，還能促進IL-1、IL-2、TNF-α、INF-γ、NO等生成，調節機體抗體和補體的形成，提高機體抗腫瘤免疫力[19]。

3.1.1 激活T/B淋巴細胞、激活抗原呈遞細胞。

高向東[20]從海洋耐鹽炭團菌（YC4108）提取得到YCP1，將YCP1作用到荷瘤小鼠體內，發現YCP1對小鼠Heps實體瘤有明顯抑制作用，抑瘤率為50.2%。YCP1經純化得到YCP2和YCP3 2種多糖組分，雖然在體外對肝癌細胞SMMC（-）21無直接殺傷作用，但試驗顯示2種組分可顯著提高小鼠脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ和巨噬細胞IL-1和TNF-α的產生能力，并與劑量大小成正比。采用RF-PCR法來探究各組分多糖對小鼠脾淋巴細胞和巨噬細胞中細胞因子基因表達的影響，結果顯示YCP2和YCP3能夠顯著提高小鼠脾淋巴細胞IL-2和IFN-γ及小鼠巨噬細胞TNF-α基因表達水平。表明炭團菌多糖的抗腫瘤作用與誘發免疫反應及提高細胞因子表達水平有關。

抗原提呈細胞（DC）在抑制腫瘤、阻礙腫瘤進行性浸潤方面有一定的作用，李明松等[21]將DC體外誘導的細胞毒T淋巴細胞（CTL）背部皮下注射回輸荷瘤裸鼠體內，并對腫瘤細胞凋亡情況進行檢測，發現DC誘導的抗腫瘤免疫主要是通過誘導移植瘤細胞凋亡來實現。

3.1.2 激活巨噬細胞。

巨噬細胞是機體內一種能夠分泌細胞毒效應分子并對腫瘤細胞與入侵到機體的外來病原微生物具有抑制或清除作用的免疫效應細胞。但無活化的巨噬細胞，其吞噬殺傷作用是有限的。溶菌酶是正常體液中抗微生物的物質之一，系巨噬細胞和白細胞所產生，測定其含量可反映該類細胞非特異性免疫功能的強弱，云芝多糖能明顯增加小鼠血清溶菌酶含量，促進巨噬細胞的非特異性免疫功能，發揮抗腫瘤作用。香菇多糖能激活巨噬細胞，增強細胞毒作用，提高NKC活性，誘導白細胞聚集發揮抗腫瘤作用[22]。海帶硫酸多糖能激活小鼠腹腔巨噬細胞，提高小鼠腹腔巨噬細胞的過氧化物酶活性及其吞噬功能，從而抑制小鼠S180肉瘤[23]。

3.2 對腫瘤細胞的直接抑制作用

楊瑾等[24]提取板橋黨參多糖研究抗腫瘤活性，對板黨多糖干預昆明小鼠的抑瘤率、安全性評價、體外增殖抑制3個方面進行測評，結果表明當板黨多糖劑量為100和200 mg/kg時，其抑瘤率分別為3416%、37.59%，雖然比環磷酰胺組抑瘤率低，但相對安全且無毒副作用，在體外增值抑制方面顯示，板黨多糖10 ug/mL對MCF-7細胞的抑制作用不明顯，100、500、1 000 ug/mL對MCF-7細胞的抑制率隨質量濃度增加而升高，呈良好的質量濃度依賴性，證明板黨多能夠直接抑制腫瘤細胞活性。還有學者研究牛膝多糖能提高荷瘤小鼠自然殺傷細胞（NKC）的活性，ABPS 100 mg/kg ip 能提高LPS誘導的TNF-α及NO的產生和NOS的活性，提高T-淋巴細胞增殖能力，并對腫瘤細胞起不同程度的殺傷和抑制作用[25]。

3.3 對癌基因的影響

p53作為公認的抗癌基因，與細胞凋亡關系密切，其表達產物對細胞增殖起負調節作用，表達產物增多意味著癌細胞活性下降[26]。魏小龍等[27]利用Northern雜交和狹線雜交的定量檢測方法，發現低分子量（1 000～2 000 u）地黃多糖（LRPS）可使小鼠Lewis肺癌細胞內的正調控基因c-fos基因表達明顯增加，負調控基因c-myc基因表達明顯減少，又采用RT-PCR的方法檢測體外多糖對p53基因表達水平的影響，結果p53基因表達明顯增加。董蘭鳳等[28]采用附子多糖和酸性多糖以腹腔注射和灌胃2種給藥途徑對荷瘤小鼠（S180、H22）進行抑瘤率研究，結果顯示2種多糖均提高了抑癌基因p53和Fas的表達，有顯著的抑瘤作用。

3.4 多糖改變腫瘤細胞膜的生長特性

多糖對腫瘤細胞膜的影響主要與唾液酸（SA）和磷脂（PI）轉換有關。SA位于細胞膜表面糖蛋白和糖脂的聚糖鏈末端，與細胞膜的許多功能有關，具有阻礙病原體附著細胞及使細胞產生免疫抗體的作用。腫瘤細胞膜SA含量的降低，與腫瘤細胞轉移、相關抗原的表達和免疫應答細胞的過程相關。PI轉換是指存在于細胞膜與內質網上的磷脂酸肌醇在其激酶催化下發生磷酸化反應的過程[26]。周永[19]從大腸桿菌中提取的莢膜多糖能抑制B16-BL16黑色素瘤細胞及MDA-MB-231乳腺癌細胞的轉移，并能降低B16-BL16對內皮細胞、細胞間的黏附分子、選擇性蛋白的黏附作用。

4 展望

先進的提取、分離、純化技術的發展，將極大地提高多糖的分離純化效率。多糖可通過促進細胞凋亡、細胞周期阻滯等機制而直接抑制腫瘤細胞生長，同時可作為免疫增強劑，通過增強機體免疫力而抑制腫瘤的發生、發展。因此，多糖作為一種潛在的新抗腫瘤藥物資源，具有良好的應用前景。

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