檉柳cpSSR—PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

張如華 張連梅

摘要 [目的]建立并優(yōu)化檉柳cpSSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。[方法]對(duì)影響PCR反應(yīng)的5個(gè)變量（Mg2+ 濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、模板DNA濃度）進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)引物退火溫度進(jìn)行梯度篩選。[結(jié)果]最優(yōu)反應(yīng)體系：Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶 0.25 U、引物 0.25 μmol/L、模板 DNA 20 ng，共10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，引物退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。[結(jié)論]該反應(yīng)體系成功擴(kuò)增1個(gè)檉柳天然群體的23個(gè)個(gè)體，為檉柳群體擴(kuò)散路線(xiàn)的確定奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 檉柳；葉綠體微衛(wèi)星；反應(yīng)體系；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) S718.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）09-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.031

Abstract [Objective] To establish and optimize the cpSSRPCR reaction system and amplification condition of Tamarix chinensis. [Method] L16（45） orthogonal design was used to identify the optimum Mg2+ concentration， dNTPs concentration， Taq concentration， primers concentration， and DNA concentration for cpSSRPCR amplification of T. chinensis ， and gradient annealing temperature test was also conducted. [Result] The optimized system was as follows： a 10 uL reaction volume including 2.0 mmol/L Mg2+， 0.125 mmol/L dNTPs， 0.25 U Taq ， 0.25 μmol/L primers， 20 ng DNA. The suitable procedure was 4 min denaturation at 94 ℃， followed by 30 cycles of 30 s denaturation at 94 ℃， 30 s annealing step at 56.5 ℃， 30s elongation at 72 ℃， and a final extension step at 72 ℃ for 10 min. [Conclusion] The optimized cpSSRPCR system successfully amplified the 23 individuas from a natural T. chinensis population and could be applied to study on population dispersal of T. chinensis.

Key words Tamarix chinensis Lour.；Chloroplast microsatellites；Reaction system；Orthogonal design

檉柳（Tamarix chinensis Lour.）屬檉柳科檉柳屬，是起源于舊大陸的古老植物，為3～6 m的灌木或小喬木。檉柳科隸屬于雙子葉植物綱五椏果亞綱，分有3屬：紅砂屬、水柏枝屬、檉柳屬，世界分布約126種植物，其中檉柳屬90種[1]。我國(guó)是檉柳屬植物的一個(gè)次級(jí)起源中心和分布中心，擁有18個(gè)種1個(gè)變種，許多為我國(guó)特有種，其中新疆分布有16個(gè)種[2]。檉柳耐鹽堿和水濕，是沿海灘涂的重要生態(tài)防護(hù)樹(shù)種[3]。檉柳自19世紀(jì)上半葉被美國(guó)自亞洲引進(jìn)后，在美國(guó)西部大面積擴(kuò)張建群，甚至替代了原生植被，被劃為入侵樹(shù)種[4]。

檉柳是檉柳屬植物中在我國(guó)分布最廣的一個(gè)種，天然分布于內(nèi)蒙、北京、河北、河南、山東、江蘇（北部）、浙江等省。目前在華東和華南部分省份發(fā)現(xiàn)有人工群體或小面積栽培。基于植物地理學(xué)研究認(rèn)為檉柳自新疆次級(jí)分布中心向東擴(kuò)散，但檉柳孢粉學(xué)證據(jù)較缺乏[5]，且又不連續(xù)，對(duì)小尺度的檉柳群體擴(kuò)散路線(xiàn)較難進(jìn)行推斷。葉綠體DNA為單親遺傳（被子植物大多為母系遺傳）的環(huán)狀DNA，進(jìn)化速率慢，遺傳變異的研究能在分子水平上重建植物的建群路線(xiàn)、鑒別栽植群體的材料來(lái)源[6]。筆者研究了檉柳葉綠體微衛(wèi)星反應(yīng)體系的建立，以期為檉柳群體擴(kuò)散路線(xiàn)確定、檉柳不同品種遺傳來(lái)源鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

檉柳采自位于山東省昌邑柳疃鎮(zhèn)鹽場(chǎng)附近的檉柳天然群體（119°21′22″ E、37°05′16″N）。為避免相關(guān)性采樣，所采植株盡量間隔50 m以上，由于群體受到人為破壞，共采取23株個(gè)體。選取植株中部成熟葉3～5 g放入裝有硅珠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃超低溫冰箱以備后序試驗(yàn)。采用改良的CTAB法[7]提取DNA，用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。提取的DNA檢測(cè)后統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL。

1.2 引物合成和PCR反應(yīng)試劑

所用檉柳葉綠體微衛(wèi)星引物為南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室自行開(kāi)發(fā)。引物上游序列：TCCCGGACGTAAGATCCTG，下游序列：ATCGTGGGACCGATTCGAAT，重復(fù)單元為（TG）5，目的片段長(zhǎng)度181 bp。由南京金斯瑞生物公司合成引物，其他PCR反應(yīng)試劑如Taq酶、dNTPs、Mg2+和Buffer均購(gòu)自 TaKaRa 公司。50 bp DNA Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物電泳分離

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)槟暇┝謽I(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的檉柳核葉綠體基因組SSR 的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃30 s，引物退火溫度30 s，72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸45 min；16 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。量取50 mL變性膠液（含21 g尿素，3.9 g丙烯酰胺，0.1 g甲叉雙丙烯酰胺；1×TBE濃度），加入180 μL APS（10%過(guò)硫酸氨）和35 μL TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）后灌膠。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入4 μL上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭，15%聚蔗糖），取1.5 μL混合液點(diǎn)在凝膠梳孔里，200 V恒電壓電泳90 min左右至溴酚蘭跑出凝膠，所用儀器為北京六一儀器廠(chǎng)DYCZ-30c型電泳槽。膠板在固定液（10%乙醇100 mL+0.5 mL純乙酸）固定10 min，AgNO3溶液（濃度為0.15%）銀染8 min，倒入顯影液（100 mL配方：1.5 g氫氧化鈉+1 mL 0.756%的四硼酸鈉+1 mL甲醛）直至顯出清晰的條帶，檢測(cè)分離結(jié)果。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和引物退火溫度篩選

對(duì)PCR反應(yīng)體系中的DNA模板濃度、引物濃度、dNTPs、Mg2+濃度和DNA Taq酶濃度進(jìn)行5因素4 水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）（表1），每種處理統(tǒng)一加10×PCR Buffer 1 μL。隨機(jī)選取2個(gè)檉柳DNA模板進(jìn)行溫度梯度設(shè)計(jì)，梯度值設(shè)為1.5 ℃，退火溫度50.0～60.5 ℃，共設(shè)8個(gè)溫度梯度。

1.5 cpSSR-PCR擴(kuò)增體系的群體檢測(cè)

運(yùn)用正交設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)反應(yīng)體系和最佳引物退火溫度對(duì)所采群體進(jìn)行擴(kuò)增初試，檢驗(yàn)所選擴(kuò)增體系和退火溫度能否有效進(jìn)行群體擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 檉柳DNA提取

改良的CTAB法能夠提取質(zhì)量好的檉柳基因組（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該方法所提取的檉柳DNA譜帶清晰、明亮、無(wú)拖尾，所提DNA在23 130 bp左右，表明所提DNA質(zhì)量好，濃度較高，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/280在1.8～2.0，濃度在100～200 ng/μL，能夠滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2 cpSSR-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果

基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同PCR反應(yīng)組合之間存在較大差異（圖2），多數(shù)反應(yīng)組合（C、D、F、G、H、I、J、K、L、N及O等12組合）僅1個(gè)模板得到有效擴(kuò)增，有的反應(yīng)組合（如A、B及P等3組合）2個(gè)模板都不能得到有效擴(kuò)增。僅E、M 2個(gè)組合有效擴(kuò)增了2個(gè)供試模板，但M組合所擴(kuò)增產(chǎn)物條帶模糊，E組合擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、產(chǎn)物豐度高，故選擇E組合為檉柳葉綠體SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其各反應(yīng)組分：Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶 0.25 U、引物 0.25 μmol/L、模板 DNA 20 ng。

2.3 退火溫度篩選

檉柳葉綠體SSR引物在一定退火梯度范圍內(nèi)，目的產(chǎn)物均能得到擴(kuò)增，但產(chǎn)物的豐度和特異性存在差異（圖3）。較低的退火溫度（如A、B、C 3個(gè)較低的溫度梯度）導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增較多，隨著退火溫度的增加，非特異性擴(kuò)增減少，但較高的退火溫度（如G、H 2個(gè)溫度梯度）擴(kuò)增的產(chǎn)物豐度降低，綜合8種退火溫度梯度處理，選擇E（56 ℃）為該引物退火溫度。該退火溫度下擴(kuò)增產(chǎn)物豐度高、條帶清晰、雜帶較弱，等位基因比較容易判讀，2個(gè)模板的擴(kuò)增產(chǎn)物具有相對(duì)一致的豐度。

2.4 反應(yīng)體系的群體檢測(cè)

采用篩選出的cpSSR-PCR反應(yīng)體系和退火溫度（56 ℃）對(duì)所采群體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，所采用的反應(yīng)體系能夠有效擴(kuò)增葉綠體目的片段（圖4）。擴(kuò)增的目的片段清晰，幾乎無(wú)雜帶，產(chǎn)物豐度相對(duì)一致，等位基因容易判讀，可為檉柳群體的大規(guī)模擴(kuò)增提供分子試驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

在16種正交組合中，除第5種和第13種組合能有效擴(kuò)增2個(gè)模板DNA外，其他組合僅能對(duì)1個(gè)模板DNA進(jìn)行目的片段的有效擴(kuò)增，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各PCR反應(yīng)組合比較靈敏，能夠反映各PCR反應(yīng)組分對(duì)檉柳葉綠體微衛(wèi)星對(duì)目的DNA擴(kuò)增效果。該試驗(yàn)退火溫度能在較大的溫度范圍內(nèi)有效擴(kuò)增目的片段，只是有豐度上略有差別；另試驗(yàn)中較低的退火溫度（A、B和C 3個(gè)溫度梯度）導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的增加，這已在其他研究中得到證實(shí)[8-9]。DNA模板濃度在試驗(yàn)中對(duì)各反應(yīng)底物濃度組合較不敏感，這與郭海林等[10]對(duì)結(jié)縷草植物的SSR擴(kuò)增與邵俊培等[11]對(duì)馬尾松的PCR-SSR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果一致。該研究采用所選cpSSR-PCR反應(yīng)體系及退火溫度能夠?qū)Σ厝后w進(jìn)行成功擴(kuò)增，表明正交設(shè)計(jì)得到的反應(yīng)體系能夠進(jìn)行檉柳群體的檢測(cè)，可為進(jìn)一步檉柳分子地理系統(tǒng)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第50卷 第2分冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1979：142-143.

[2] 張道遠(yuǎn).檉柳科系統(tǒng)學(xué)研究中一些問(wèn)題探討[J].云南植物研究，2005，27（5）：471-478.

[3] 董必慧.江蘇沿海灘涂檉柳的繁殖生物學(xué)特性及開(kāi)發(fā)前景[J].林業(yè)科技，2004，29（1）：4-7.

[4] GASKIN J F，KAZMER D J.Comparison of ornamental and invasive saltcedar in the USA northern Great Plains using chloroplast and nuclear DNA sequence markers [J].Wetlands，2006，26（4）：939-950.

[5] 潘曉玲.塔里木盆地植物區(qū)系的研究[J].新疆大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1994，11（4）：77-83.

[6] DUMOLIN S，DEMESURE B，PETIT R J.Inheritance of chloroplast and mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method [J].Theoretical and applied genetics，1995，91（8）：1253-1256.

[7] 張博，張露，諸葛強(qiáng)，等.一種高效的樹(shù)木總DNA 提取方法[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，28（1）：13-16.

[8] 張美玲，李巧明.瀕危植物望天樹(shù)SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，33（S2）：425-432.

[9] 何仁鋒，馮尚國(guó)，陳喆，等. 藥用菊花 SSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].分子植物育種，2015，13（2）：367-378.

[10] 郭海林，王志勇，薛丹丹，等.結(jié)縷草屬植物SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9（2）：138-143.

[11] 邵俊培，李志輝，楊模華，等.馬尾松EST-SSR PCR體系的優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：159-163.