黃花柳3個無性系葉色及葉綠素熒光特性比較

王曉葉 王力源 劉興菊

摘要 [目的]了解黃花柳資源的變異特性。[方法]以黃花柳3個無性系為材料，通過柯尼卡CR-400全自動色差計對其葉色參數進行測定，通過乙醇提取方法對其葉綠素含量進行測定，使用Pocket PEA快速熒光儀對其葉綠素熒光特性進行分析比較。[結果]葉綠素含量與L、a均呈顯著負相關；金枝黃花柳的葉色偏黃、葉綠素含量較低，但其潛在光化學活性最強，對強光脅迫具有較強的自我保護能力；普通黃花柳葉色偏綠、葉綠素含量較高，其潛在光化學活性也較強，但其對光能的利用率最低；紅枝黃花柳的葉色較金枝黃花柳偏綠，較普通黃花柳偏黃，其葉綠素含量與光能利用率均介于二者之間。[結論]葉綠素含量越高葉片顏色越偏綠色且越明亮；金枝黃柳較其他2個黃花柳無性系葉片顏色更鮮艷，且其光化學活性最強，對光能的利用率最大。

關鍵詞 黃花柳；葉色參數；葉綠素；葉綠素熒光特性

中圖分類號 S718.46 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0118-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.035

Abstract [Objective]To know about the variation characteristics of the resources of Salix caprea.[Method]We used three clones of S. caprea as experimental materials，determined its leaf color parameters by Konica CR400 and its chlorophyll content by ethanol extraction method. The fluorescence characteristics of the chlorophyll were analyzed and compared using the Pocket PEA fast fluorometer.[Result]The chlorophyll content was negatively correlated with Lvalue and avalue. S. caprea ‘GoldenStem had yellow color leaves and lower chlorophyll content， but its photochemical activity was the strongest， so it had strong selfprotection ability against strong light stress.For common S.aprea，its leaf color was greenish， the chlorophyll content was higher， and its potential photochemical activity was stronger.The color of S. caprea ‘RedenStem was greenish compared with the S.aprea‘GoldenStem， the chlorophyll content and utilization of light energy were between the two clones.[Conclusion]The higher the chlorophyll content， the more green and bright the leaves are. The color of S.aprea ‘GoldenStem is more vivid than the other two clones， and S.aprea‘GoldenStem had strongest photochemical activity and maximum utilization of light energy.

Key words Salix caprea；Leaf color parameters；Chlorophyll；Chlorophyll fluorescence characteristics

柳樹是楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）植物的統稱，柳屬植物分布廣泛，種類繁多，目前已知全世界有520種，我國有257種[1]，122變種，大多是灌木。柳樹在我國是重要的闊葉樹種，是游憩林、防護林、水土保持林、風景林及用材林的重要組成樹種，具有很高的生態、經濟、美學價值[2-4]。黃花柳（Salix caprea）為其中一種，為灌木或小喬木，枝條黃綠色至紫紅色，葉片卵狀長圓形、寬卵形至倒卵狀長圓形，雄花花序闊橢圓形，花藥黃色，具有很高的觀賞價值。柳樹長期生長在自然條件下，受周圍環境及種間或屬間雜交的影響很容易發生變異，具有豐富的遺傳多樣性[5]，通過黃花柳的一些生理指標可以了解到其變異特征，但在以往的關于柳樹的研究中很少有對不同表現型黃花柳進行研究的。筆者選擇黃花柳3個表現型的無性系為材料，對黃花柳3個無性系葉色參數、葉綠素含量以及葉綠素熒光特性進行分析比較，以期了解黃花柳資源的變異特性，為優良品種的選育工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地為河北農業大學林學苗圃。以來自河北省張家口小五臺山自然保護區的3個黃花柳無性系（金枝黃花柳、紅枝黃花柳、普通黃花柳）2年生扦插苗為材料，進行葉色、葉綠素含量、葉綠素熒光特性的測定及比較。

1.2 方法

1.2.1

葉片色差參數的測定。葉片色差的測定方法參照劉晶芳等[6]，使用柯尼卡CR-400全自動色差計分別測定3個黃花柳無性系健康枝條上中部（第6或7位）成熟健康的葉片，每種黃花柳隨機選取3個健康的枝條作為3個重復。使用色差計測定其L、a、b值，其中，L值表示葉片亮度，L值越高則葉片的亮度越大；a值表示紅/綠，a值為正值時其值越大則葉片越偏紅，其值為負值時絕對值越大則葉片越偏綠；b值表示黃/藍，b值為正值時其值越大則葉片越偏黃，其值為負值時絕對值越大則葉片越偏藍。

1.2.2

葉綠素含量的測定。分別摘取普通黃花柳、金枝黃花柳、紅枝黃花柳的中部葉片帶回實驗室，用清水洗去表面塵土，用吸水紙吸干表面水分，將葉片剪碎混合，分別稱取葉片0.2 g于10 mL離心管中，加入10 mL 95%乙醇，每種黃花柳3個重復，黑暗處理浸提48 h，用分光光度計分別測定其在663、645 nm下的吸光值，計算葉綠素a和葉綠素b的含量。

1.2.3 葉綠素熒光參數的測定。于10：00左右在苗圃地選取3個黃花柳無性系中部的成熟健康葉片暗處理20 min，使用Pocket PEA快速熒光儀，分別測定3個黃花柳無性系中部葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm），然后按照公式Fv=Fm-Fo計算出可變熒光Fv進而得到PSⅡ的原初光化學效率（Fv/Fm）以及PSⅡ的潛在光化學活性（Fv/Fo）。用PAM-2500便攜式熒光儀分別測定3個黃花柳無性系中部葉片的光化學淬滅系數（qP）以及非光化學淬滅系數（NPQ）。

1.3 數據處理與分析

使用Excel和DPS軟件對測定數據進行分析和圖形繪制，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及相關性分析研究不同品種間各個指標的變異情況及不同指標之間相關性大小，運用Duncans比較法進行平均值間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃花柳3個無性系葉色的比較

L值表示葉片光澤程度，a值表示葉片的紅/綠，b值表示葉片的黃/藍。從圖1可以看出，金枝黃花柳的L值為52.82，普通黃花柳和紅枝黃花柳的L值分別為46.53和45.46，金枝黃花柳的L值顯著高于普通黃花柳和紅枝黃花柳，而普通黃花柳與紅枝黃花柳的L值無顯著差異，說明相同位置下金枝黃花柳葉片比普通黃花柳和紅枝黃花柳的葉片明亮，普通黃花柳與紅枝黃花柳葉片光澤程度相近；3個無性系黃花柳葉片的a值均為負值，金枝黃花柳的a值為-7.00，普通黃花柳與紅枝黃花柳的a值分別為-13.98和-14.34，金枝黃花柳的a值顯著高于其他2個無性系，說明相同位置下3個無性系的葉色均呈現綠色，而金枝黃花柳的葉色呈現的綠色較淺，其他2個無性系的葉色更偏向深綠色；黃花柳3個無性系葉片的b值均為正值，且三者之間均存在顯著差異，以金枝黃花柳最大為25.72，紅枝黃花柳最小為20.96，說明3個黃花柳無性系的葉片均偏黃，以金枝黃花柳的葉片偏黃程度最大。就金枝黃花柳而言，3個值與其他2個無性系差異均極顯著，而其他2個無性系3個值之間并無顯著差異，一定程度上難以區分。

2.2 黃花柳3個無性系葉綠素含量的比較

葉綠素是綠色植物光合作用的重要結構體，其含量的多少是衡量植物光合作用的重要指標[7]。從圖2可以看出，黃花柳3個無性系的葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總含量均存在顯著差異，以普通黃花柳的葉綠素含量最高，其葉綠素a、葉綠素b及葉綠素（a+b）含量分別為1.33、0.44和1.77 mg/g。金枝黃花柳最低，其葉綠素a、葉綠素b及葉綠素（a+b）含量分別為1.02、0.37和1.39 mg/g。說明在正常生長環境下，普通黃花柳的葉片對于光能的吸收能力較其他2個無性系強。對于葉綠素b的吸收能力三者并無顯著差異。3個黃花柳無性系的葉綠素a含量均是葉綠素b的2倍以上，說明正處于生長期的黃花柳光合作用大于呼吸作用，處于有機物的積累階段。

2.3 葉綠素含量與葉色參數的相關分析

由表1可以看出，葉色參數a、b值與L值呈極顯著正相關，說明葉片的光亮程度受葉片顏色的影響極大。葉綠素含量與葉色參數（L值、a值）之間均存在顯著負相關，葉綠素a、葉綠素（a+b）與葉色參數a值之間存在極顯著負相關，葉綠素b與葉色參數a值之間存在顯著負相關，說明葉綠素含量越高葉片呈現的顏色越偏綠色且葉片明亮有光澤，而葉綠素含量與葉色參數b值無顯著相關性，說明葉綠素含量與葉片黃藍色無明顯的相關性。

2.4 黃花柳3個無性系葉綠素熒光特性的比較

Fv/Fo通常被用來度量PSⅡ的潛在光化學活性；Fv/Fm反映PSⅡ反應中心的光能轉化效率。在非逆境條件下，不同種類或生態型維管植物葉片的光能轉化效率Fv/Fm通常有固定的表現，均在0.832左右[8]。由表2可以看出， Fv/Fo和Fv/Fm 均以普通黃花柳最高（Fv/Fo為3.97，Fv/Fm為0.80），紅枝黃花柳最低（Fv/Fo為3.58，Fv/Fm為0.77），普通黃花柳和金枝黃花柳之間的差異不顯著，可見普通黃花柳的光能轉化效率最高。淬滅系數包括光化學淬滅系數（qP）和非光化學淬滅系數（NPQ），qP是PSⅡ激發能捕獲效率的體現，在一定程度上反映了PSⅡ反應中心的開放程度[9]，NPQ反映PSⅡ天線色素所吸收的光能沒有被用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的那部分光能，NPQ越高則植物的熱耗散能力越強，即植物對于強光脅迫下光合機構的保護能力越強，反之越差[10]。從表2可以看出，紅枝黃花柳的NPQ最大為0.58，普通黃花柳最小為0.33。普通黃花柳的qP顯著高于金枝黃花柳但與紅枝黃花柳無顯著差異。可見紅枝黃花柳的PSⅡ反應中心的開放程度較高，普通黃花柳的熱耗散能力較強。

將綠色植物或含有葉綠素的部分組織進行暗適應后，突然暴露在可見光下，植物綠色組織會發出暗紅色，強度隨時間不斷變化的熒光信號，以熒光信號做出的曲線稱為葉綠素熒光誘導動力學曲線。快速葉綠素熒光誘導動力學曲線指的就是從O點到P點的熒光變化過程[11-12]。典型的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線呈現O、J、I、P相，O相為剛暴露在光下時的最低熒光，此時 PSⅡ反應中心處于“完全開放”狀態；O-J相是QA被還原成QA-的過程，故J相（2 ms）反映了QA-的大量積累；J-P相是QB接受QA-的電子的過程，但這個過程分為2部分，J-I相是電子傳遞過程中快還原性PQ庫先被完全還原的過程，I-P相是慢還原型PQ庫被還原的過程，P相為熒光的最高峰，QA和QB是2個重要的光合電子傳遞體，決定著電子傳遞的效率[13-14]。

圖3為3個黃花柳無性系的熒光動力學（OJIP）曲線。從圖中可以看出，3個黃花柳無性系的OJIP曲線變化趨勢基本一致，在O相（20 μs）至J相（2 ms）之間普通黃花柳和紅枝黃花柳的差異不明顯，但均顯著高于金枝黃花柳，說明普通黃花柳和紅枝黃花柳的受體側的電子傳遞效率低于金枝黃花柳；在J相至I相之間普通黃花柳和紅枝黃花柳之間的差異開始變大；在I相（30 ms）黃花柳3個無性系的差異更加明顯，普通黃花柳和紅枝黃花柳的差異變大；在I-P相，3個黃花柳無性系中，普通黃花柳熒光強度>紅枝黃花柳熒光強度>金枝黃花柳熒光強度，說明PSⅡ中PQ庫的還原能力從大到小依次為金枝黃花柳、紅枝黃花柳、普通黃花柳。

3 結論與討論

（1）通過對黃花柳3個無性系葉色參數的比較，發現金枝黃花柳較其他2個無性系的葉片顏色偏黃綠且葉片更有光澤，紅枝黃花柳較普通黃花柳的葉色偏黃，但明亮程度均相近，普通黃花柳的葉色為綠色。

（2）通過對葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總含量的比較分析，發現黃花柳3個無性系葉片的葉綠素a、葉綠素b含量以及葉綠素總含量的高低表現一致，均依次為普通黃花柳、紅枝黃花柳、普通黃花柳。

（3）通過葉色參數與葉綠素含量的相關性分析，發現葉綠素a、葉綠素b均與葉色參數a值呈顯著負相關，與b值呈不顯著性負相關，即葉綠素a和葉綠素b含量越高葉色呈現的綠色越明顯，該研究結果與郭歡歡等[15]對葉綠素含量與葉片顏色的研究結果一致。通常認為，植物葉片中的葉綠素a呈藍綠色，葉綠素b呈黃綠色但不穩定易分解[16-17]。此次試驗并不能說明葉綠素a和葉綠素b是呈現藍綠色還是黃綠色，可能是由于葉綠素a和葉綠素b所呈現的藍綠色和黃綠色中綠色更為明顯，此次試驗用到的儀器不能更加精確地體現黃藍度也是其中一個原因。

（4）利用葉綠素熒光參數及動力學曲線探測黃花柳3個無性系的光反應過程，結果顯示，Fv/Fo和Fv/Fm 均表現為普通黃花柳顯著高于紅枝黃花柳，金枝黃花柳與其他2個無性系均無顯著差異，說明原初潛在光化學活性最高的是普通黃花柳；普通黃花柳的qP最高，而紅枝黃花柳的NPQ最大，說明普通黃花柳的熱耗散能力強，但在強光脅迫下具有較強保護能力的是紅枝黃花柳。在葉綠素熒光動力學（OJIP）曲線中金枝黃花柳顯著低于其他2個黃花柳無性系，說明金枝黃花柳葉片的PSⅡ反應中心所捕獲的能量中用于電子傳遞的比例最高，一定程度上反映了金枝黃花柳葉片的反應活性最高，對光能的利用率最高。

綜上所述，通過對黃花柳3個無性系的葉色、葉綠素熒光特性進行分析比較，發現葉綠素含量越高葉片顏色越偏綠色且越明亮；金枝黃花柳較其他2個黃花柳無性系葉片顏色更鮮艷，且其潛在光化學活性最強。黃花柳3個無性系的差異顯著的原因有很多，環境壓力對植物形態變異有較大影響[18]，因此，3個無性系之間的差異可能是受環境影響而產生的變異，但也有可能是源自自身的變異，還需要分子鑒定來進一步深入研究確認產生變異的原因。

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