咪唑類離子液體在榿葉棠棣總黃酮提取工藝中的應用

潘思源 田英姿

摘要 [目的]以提取率為主要評價指標，探討咪唑類離子液體提取榿葉棠棣總黃酮的最佳工藝。[方法]通過對比不同種類、濃度的提取溶劑和不同提取方法初步確定提取工藝，并應用單因素試驗和響應面Box-Behnken試驗對關鍵因素進行優化。[結果]選取0.7 mol/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑水溶液為提取溶劑，其提取效率高于其他離子液體及70%甲醇、70%乙醇等傳統有機溶劑；微波輔助法相比熱回流法和超聲輔助法具有顯著優越性，提取得率高且可重復性好。在微波提取工藝的響應面試驗中，液料比對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響最為顯著，最佳工藝條件：提取溫度72 ℃、提取時間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），在此條件下平均得率達12.75 mg/g。[結論]咪唑類離子液體在微波環境下能夠有效提高榿葉棠棣總黃酮提取率，優化后的工藝參數可為其工業化生產和科學研究提供理論依據。

關鍵詞 榿葉棠棣；總黃酮；離子液體；提取工藝；響應面

中圖分類號 R282.4 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.046

Abstract [Objective] The extraction rate was the main evaluation index， and the optimal extraction process for total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt. was studied. [Method] The initial extraction process was determined by comparing different extraction methods and extraction solvents of different types and concentrations. The key factors were optimized by single factor tests and BoxBehnken tests. [Result] 0.7 mol/L 1butyl3methylimidazolium bromide was selected as the extraction solvent， and the extraction efficiency was higher than other ionic liquids， 70% methanol， 70% ethanol and other traditional organic solvents；compared with the thermal reflux method and the ultrasonicassisted method， the microwaveassisted method has significant superiority， such as high extraction yield and good repeatability. In the response surface test of microwaveassisted extraction process， materialliquid ratio had the most significant effect on the extraction rate of total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.， and the optimum conditions were as follows： extraction temperature 72 ℃， extraction time 16.5 min， liquidsolid ratio 24.5 mL/g， the average yield in repeated extraction of three times could reach 12.75 mg/g. [Conclusion] The imidazole ionic liquid under microwave condition can effectively improve the extraction rate of total flavonoids from Amelanchier alnifolia Nutt.. The optimized parameters in extraction process can provide corresponding theoretical basis for industrial production and scientific research.

Key words Amelanchier alnifolia Nutt.；Total flavonoids；Ionic liquid；Extraction process；Response surface method

榿葉唐棣（Amelanchier alnifolia Nutt.）是一種發展迅速、風味獨特的薔薇科小漿果，原產自北美洲中西部，現已引種至我國新疆、甘肅、吉林等省份[1]。榿葉棠棣果實富含抗氧化劑、水果膳食纖維及鈣、磷、鎂、錳等人體所需礦物元素，近年來作為功能性食品被廣泛關注，需求量也日漸上漲[2]。研究表明，黃酮類化合物是榿葉棠棣成熟果實中抗氧化劑的主要成分，包括黃酮醇類、黃烷類（聚合度不同的原花青素）和花青素等，在人體血壓控制和消炎抗癌方面功效突出，藥用價值極其可觀[3-4]。目前，國內對榿葉棠棣的研究僅限于種植栽培[5]、釀造工藝[6-7]和果膠[8]、花青素[9]、花色苷[10]等活性成分方面，開發其總黃酮的提取工藝意義重大，提取產物可廣泛應用于食品、醫藥及保健品領域。

研究表明，離子液體（Ionic liquids，IL）能替代傳統有機溶劑提取植物資源中的黃酮類化合物，提取率高且綠色環保，其中咪唑類離子液體的萃取效果最為顯著。Dróz·dz·等[11]用3種咪唑類離子液體提取石楠花總黃酮，提取率遠高于60%乙醇溶液和乙酸乙酯。Wang等[12]從15種結構不同的離子液體中選擇提取效率最佳的溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）用于超聲輔助法提取毛竹葉總黃酮。杜芳艷等[13]將[Bmim]Br離子液體和微波提取工藝相結合提取海紅果渣總黃酮，提取時間及溶劑消耗量大幅減少。

為此，筆者以咪唑類離子液體的水溶液（甲醇溶液、乙醇溶液和乙酸乙酯）為提取溶劑，采用不同方法提取榿葉棠棣總黃酮（total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.，TFAN），依據提取得率篩選出最合適的提取工藝，并設計單因素和響應面試驗進行優化，對TFAN的實際生產具有一定參考作用，同時為其功能性產品的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉棠棣：水西溝2號，引種自加拿大，采自新疆烏魯木齊縣。蘆丁標準品（HPLC≥98%），源葉生物公司；[Bmim]Br、溴化1-己基-3-甲基咪唑（[Hmim]Br）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[Omim]Br），純度均≥97%，阿拉丁公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MCR-3常壓微波化學反應器，貝侖儀器公司；ALPHA2-4 LSC實驗室凍干機，德國Marin Christ公司；UV-2600紫外可見分光光度計，島津公司；TGL20MC高速冷凍離心機，英泰儀器公司；LK-2000A中藥高速粉碎機，精勝儀器公司；超聲波清洗器、恒溫水浴鍋、分析天平、真空泵等實驗室常用儀器。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理。篩選出大小均一的榿葉棠棣鮮果，清洗風干后放入粉碎機中切開，充分粉碎。將粉碎后的原料完全轉移至冷凍干燥機中連續處理16 h，再次粉碎脫水原料，過60目篩，裝袋封口置于干燥、低溫環境下貯存。

1.3.2 榿葉棠棣總黃酮的提取及測定。

1.3.2.1

TFAN的提取步驟。用分析天平稱取榿葉棠棣粉末樣品1.000 g，置于150 mL圓底三口燒瓶中，按預先設定的液料比加入提取溶劑，分別采用熱回流、超聲輔助及微波輔助工藝提取TFAN。若提取溶劑為咪唑類離子液體的水溶液，則在提取結束后進行冷凍離心及針式濾器壓濾處理；若提取溶劑為其他3種有機溶劑，則直接轉移至坩堝式濾器中充分抽濾。用對應種類和濃度的提取溶劑將濾液定容至50 mL，作為TFAN待測液備用。

1.3.2.2

蘆丁標準曲線的繪制。參照楊潤亞等[14]的方法，蘆丁標準品的濃度為0.25 mg/mL，采用“NaNO2-Al（NO3）3-NaOH”顯色體系和紫外可見分光光度計測定蘆丁標準曲線（λ=510 nm處有最大吸收峰）。

1.3.2.3

TFAN提取率的測定。用移液槍移取TFAN 待測液2.0 mL，按照“1.3.2.2”中的方法依次加入顯色體系所用試劑并搖勻、靜置，顯色處理完成后在510 nm波長處測定其吸光度，代入回歸方程求出相應的總黃酮質量m0（mg）。測定過程中以60%乙醇溶液為校準液，經全波長掃描，咪唑類離子液體的水溶液及3種有機溶劑在此波長下均無吸收峰，對待測液中黃酮類化合物質量的測定無干擾。TFAN提取率計算公式：Y=（25×m0）/m1。式中，Y為TFAN提取率（mg/g），25為定容待測液體積與轉移待測液體積之比，m1為榿葉棠棣粉末樣品的質量（g）。

1.3.3

提取溶劑種類及濃度的選擇。采用微波輔助法提取TFAN，不同提取溶劑的用量均為20 mL，設定反應條件為提取功率400 W、提取溫度60 ℃、提取時間20 min，依據TFAN提取率及過濾操作的難易程度篩選出最佳溶劑種類。溶劑分別為70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、乙酸乙酯、[Bmim]Br溶液、[Hmim]Br溶液、[Omim]Br溶液（離子液體濃度均為0.6 mol/L）。用超純水將該溶劑配制成一定濃度梯度（0.4～1.2 mol/L）的溶液，在上述提取條件下分別提取TFAN，提取率最高的濃度用于后續試驗。

1.3.4 不同提取方法的比較。設定熱回流法、超聲輔助法及微波輔助法的工藝參數[15]，用“1.3.3”中所確定的提取溶劑分別提取TFAN，各方法重復3次，通過評價TFAN提取率、提取耗時、相對標準偏差等參考指標確定最佳提取方法。為了使提取過程穩定、快速升溫，且不破壞黃酮類化合物的結構和活性，試驗所用超聲波及微波的功率均為400 W[16]。

1.3.5

單因素試驗設計。以上述最佳提取方法為研究對象，將提取溫度（40～90 ℃）、提取時間（5～30 min）、液料比[10∶1～35∶1（mL∶g）]作為單因素試驗的3個因素，分別研究各因素對TFAN提取率的影響規律和優勢水平。

1.3.6

Box-Behnken試驗設計。根據“1.3.5”中的結果設計響應面試驗優化提取工藝，TFAN提取率為響應值（Z），具體因素及水平見表1。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準化曲線

蘆丁標準品質量M與吸光度A的回歸方程為A=1.1664M-0.0061（R2=0.998 7），在0.05～0.50 mg時可用于TFAN的定量測定（圖1）。

2.2 提取溶劑的確定

2.2.1 溶劑種類對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。由圖2可知，70%甲醇溶液的提取率為7.03 mg/g，雖比70%乙醇溶液和乙酸乙酯高，但不及3種濃度為0.6 mol/L的咪唑類離子液體溶液，一方面是因為離子液體對TFAN的溶解能力比傳統有機溶劑強，另一方面是因為離子液體可以溶解植物細胞壁中的纖維素，促使有效成分釋放至細胞外。此外，[Bmim]Br溶液的提取率達8.75 mg/g，高于[Hmim]Br溶液和[Omim]Br溶液，可能是因為較長的陽離子烷基鏈帶來了更大的空間位阻效應和傳質阻力，離子液體對細胞壁的破壞能力也有所減弱，在降低提取率的同時還增大了針式過濾操作所需的壓力，且鏈長越長過濾速度越慢[15]。因此，選擇TFAN提取率最高、便于過濾的[Bmim]Br溶液作為提取溶劑。

2.2.2 [Bmim]Br濃度對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。由圖3可知，當[Bmim]Br溶液濃度從0.4 mol/L增大到0.7 mol/L時，溶劑中主要起溶解和傳質作用的離子液體不斷增多，TFAN提取率隨之升高。繼續增大溶液濃度，TFAN提取率逐步下降，考慮到[Bmim]Br離子液體呈高度黏稠狀，濃度越大導致提取溶劑的黏度越大，較強的傳質阻力會抑制TFAN溶出。另外，由相似相溶原理可知，[Bmim]Br溶液的極性越接近于榿葉棠棣總黃酮中主要物質的極性范圍，則TFAN的溶解和溶出程度越大，表現出較高的提取效率，而提取溶劑的濃度是決定其極性大小的關鍵因素之一[17]。綜合以上因素，選取[Bmim]Br溶液的濃度為0.7 mol/L，此時TFAN提取率有最大值10.33 mg/g。

2.3 3種提取方法的比較

由表2可知，傳統熱回流法的TFAN提取率最低，且提取過程耗時長、反應所需溫度高、工藝較為繁瑣。另外，在相同工藝參數下，超聲輔助法的TFAN

提取率比微波輔助法低0.64 mg/g，且RSD值高1.3%，多次

提取的重復性差。造成這一結果的原因可能是離子液體與微波間的熱效應比超聲波協同作用強，升溫和控溫過程也更為穩定，為黃酮類化合物的溶出提供了有利條件，故微波輔助法較其他2種方法具有顯著優越性。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1

提取溫度對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取時間20 min、液料比20∶1（mL∶g），測定提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃時的TFAN提取率，結果見圖4。由圖4可知，當微波提取的設定溫度從40 ℃增大到70 ℃時，黃酮類化合物的運動速率不斷加快，在離子液體中的溶解性及擴散程度提高，TFAN提取率隨之上升。但繼續升高溫度導致TFAN提取率有所降低，這是因為在高溫環境下結構相對不穩定的TFAN會被氧化，溫度越高氧化程度越大，同時有悖于提取過程“節能降耗”的發展方向。故選擇提取溫度60～80 ℃為該因素在響應面試驗中的水平。

2.4.2

提取時間對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取溫度60 ℃、液料比20∶1（mL∶g），測定提取時間5、10、15、20、25、30 min時的TFAN提取率。結果見圖5。由圖5可知，在15 min前TFAN提取率隨時間延長迅速上升，主要與TFAN在不同時間點的溶出程度有關，達到完全溶出需要一定反應時間。提取時間繼續延長，TFAN提取率呈緩慢下降趨勢，這是因為微波的強熱效應會破壞部分TFAN的內部結構，處理時間越長，被分解的黃酮類化合物越多。故選擇提取時間10～20 min為該因素在響應面試驗中的水平。

2.4.3 液料比對榿葉棠棣總黃酮提取率的影響。固定提取溫度60 ℃、提取時間20 min，測定液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g）時的TFAN提取率，結果見圖6。由圖6可知，TFAN提取率隨液料比的增加先上升后降低，當液料比為25∶1（mL∶g）時提取率最大。溶劑的增加會使TFAN在離子液體中的溶解更加充分，傳質速率及溶出速率加快；但溶劑過多會導致微波升溫過程減慢、雜質溶出量增加，不僅使TFAN提取率大幅降低，還增加了生產成本和過濾操作的難度。故選擇液料比20∶1～30∶1（mL∶g）為該因素在響應面試驗中的水平。

2.5 響應面試驗結果

Box-Behnken試驗結果見表3，運用Design-Expert軟件進行二次回歸擬合，建立自變量提取溫度（X1）、提取時間（X2）和液料比（X3）與響應值TFAN提取率（Z）的數學模型，所得回歸方程：

Z=12.62+0.20X1+0.31X2-0.39X3+0.038X1X2+0.059X1X3-0.021X2X3 -0.52-0.55-1.80

ANOVA分析結果見表4。由表4可知，模型整體具有統計學意義，達極顯著水平（P<0.000 1）；失擬項不顯著（P>0.05）表明模型穩定，不易受外界因素影響；變異系數CV=

1.34%和決定系數R2Adj=0.981 5表明模型的擬合度與精確度較高，可替代具體試驗分析此工藝中TFAN提取率的變化。X1、X2、X3及其二次項均為極顯著因素，對TFAN提取率均影響較大；3個交互項不顯著，說明因素間兩兩相互作用對試驗結果的影響較弱。根據結果差異性（P）及方程一次項系數的絕對值判斷，各因素對TFAN提取率的影響表現為液料比（X3）>提取時間（X2）>提取溫度（X1）。

由圖7可知，TFAN提取率的最高值均分布在各因素所選取的水平范圍內，因此該模型可用來預測的極值點所在位置。沿液料比方向，3D曲面的陡峭程度最大，且等高線分布最為密集，故液料比對TFAN提取率的影響較其他2個因素更為顯著；對比各圖中等高線的形狀，提取溫度和液料比的等高線呈橢圓形且弧度最大，說明X1X3的交互作用強于X1X2和X2X3，但仍未達顯著水平[18]。

由回歸方程可得微波輔助法的理論最佳工藝條件：提取溫度72.02 ℃、提取時間16.46 min、液料比24.46（mL∶g），TFAN提取率為12.71 mg/g。根據實驗室儀器精度，將工藝修正為提取溫度72 ℃、提取時間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），重復提取3次進行驗證，TFAN提取率為12.75 mg/g，RSD為0.72%，與理論值基本吻合。

3 結論

采用不同種類和濃度的溶劑提取榿葉棠棣總黃酮，咪唑類離子液體水溶液較傳統有機溶劑表現出更好的提取特性，尤其是濃度0.7 mol/L[Bmim]Br溶液。對比3種提取方法，微波輔助法的提取效率高于熱回流法及超聲輔助法，離子液體在微波環境下所產生的強熱效應更有利于黃酮類化合物的溶出。

通過單因素和Box-Behnken試驗研究微波輔助[Bmim]Br溶液提取榿葉棠棣總黃酮，所得最佳提取工藝為提取溫度72 ℃、提取時間16.5 min、液料比24.5（mL∶g），驗證試驗的平均提取得率為12.75 mg/g，與回歸方程的預測結果相符，模型可靠性高。在選取的3個獨立因素中，液料比對提取率的影響最為顯著（P=0.000 2），是該工藝中的關鍵性因素。

該研究針對榿葉棠棣總黃酮提供了一種高效、綠色的提取工藝，對其分離純化、成分分析、功能特性、開發應用等研究具有一定借鑒意義，且咪唑類離子液體可通過反萃取法進行回收，規避了自身價格高昂所帶來的生產成本。

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