非小細胞肺癌患者熱休克蛋白90α、凋亡促進因子Bax、凋亡抑制因子Bcl-2表達水平變化及與病理學特征的相關性

陳濤，杜維

（湖南省常德市第一人民醫院 1.檢驗科；2.病理科，湖南 常德 415000）

流行病學研究表明，我國部分地區2010年至2017年非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的發病率可達284～583/1 萬人左右［1］。臨床上NSCLC 的發生，能夠導致患者無瘤生存時間和中位生存時間的下降，增加了患者短期內的病死率［2-3］。

在探討NSCLC 的生物學進展機制的過程中，可以發現腫瘤相關調控蛋白的改變，能夠通過影響到癌細胞的凋亡、分化和增殖過程，進而參與NSCLC 的病情進展過程。熱休克蛋白90α（heat shock protein-90α, HSP90α）的表達上升，能夠通過影響癌細胞的核轉錄水平，提高了癌細胞的浸潤和黏附能力［4］；凋亡促進因子Bax（Bcl-2 associated X） 與凋亡抑制因子Bcl-2（B cell lymphoma-2, Bcl-2）相關X 蛋白的表達，能夠通過激活癌細胞內鈣離子相關信號通路，進而導致細胞程序性凋亡比例的上升，促進了腫瘤病灶的萎縮和腫瘤細胞的消退［5］；凋亡抑制因子Bcl-2 的B 淋巴細胞瘤-2 基因的表達，能夠通過影響到阻斷癌細胞內第二信使的活性，提高癌細胞轉錄上游啟動子的活性，進而促進肺泡上皮細胞的持續性增殖，抑制肺泡上皮細胞的凋亡［6］。部分研究者探討了Bax、Bcl-2 的表達與NSCLC 的關系，認為Bax、Bcl-2 的表達與NSCLC 的病情進展密切相關［7］，但缺乏對于HSP90α 的表達與NSCLC 的臨床病理特征的關系研究。為了揭示HSP90α、Bax、Bcl-2 的表達與NSCLC 的病情關系，從而為臨床上NSCLC 患者的診療分析提供理論方面的參考，本次研究選取2012年1月至2017年12月本院保存的NSCLC 組織110 例，探討了HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達與肺癌的病情關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2017年12月本院保存的NSCLC 組織110 例（NSCLC 組），納入標準：①均經病理組織學確診；②手術前未行放化療等治療；③臨床病理資料保存完整。排除標準：①臨床資料欠缺；②合并有其他惡性腫瘤者。同時選取手術切除的肺良性病變組織100 例作為對照組（其中肺大泡42 例，炎性假瘤33 例，支氣管擴張25 例）。本研究已獲得醫院倫理委員會審批，納入研究患者及其家屬都已知情同意。NSCLC 組和對照組患者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 NSCLC 組和對照組一般資料比較（±s）

表1 NSCLC 組和對照組一般資料比較（±s）

組別NSCLC組對照組t/χ2值P值例數110 100男/女/例65/45 60/40 0.018 0.893年齡/歲59.42±4.11 60.10±5.20-1.056 0.292體重指數/(kg/m2)22.43±3.21 22.79±3.05-0.831 0.407

1.2 實驗方法

采用石蠟進行連續性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購自南京博奧生物科技公司），封閉2 h，倒去封閉液后加入一抗（兔來源濃度1∶1 000～1 500），4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，加入二抗（鼠來源1∶400～500），室溫孵育20～30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標記物，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每日3～5 min，滴加顯色劑（DAB 購自南京博奧生物科技公司），復染，脫水，封片。

1.3 結果判斷

HSP90α、Bax、Bcl-2 蛋白定位于胞漿，呈黃色顆粒狀；隨機選取5 個高倍鏡視野，每個視野計數100 個細胞，總計500 個細胞，采用半定量積分法，對染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細胞比例：＜10%為1 分，10%～25%為2 分，26%～50%為3 分，≥51%為4 分。最終得分為染色強度和陽性細胞比例得分之積，分數≥4 分為陽性表達。

1.4 統計學方法

統計分析采用SPSS 19.0 軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，相關性采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 組和對照組HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達比較

NSCLC 組HSP90α 和Bcl-2 蛋白陽性表達率明顯高于對照組（P＜0.05），而Bax 蛋白陽性表達率明顯低于對照組（P＜0.05）。見表2 和圖1。

2.2 HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達與NSCLC 患者臨床病理關系

III 期、有淋巴結轉移患者HSP90α 蛋白陽性表達率明顯高于I～II 期、無淋巴結轉移患者（P＜0.05）；腫瘤直徑＞3 cm 患者Bcl-2 蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤直徑≤3 cm 患者（P＜0.05）；中低分化患者Bax 蛋白陽性表達率明顯低于高分化患者（P＜0.05）。見表3。

表2 兩組HSP90α、Bax 和Bcl-2 蛋白陽性表達率比較 例（%）

圖1 免疫組化（×400）

表3 HSP90α、Bax 和Bcl-2 表達與NSCLC 患者臨床病理關系 例（%）

續表3

2.3 HSP90α、Bax和Bcl-2表達相關性

NSCLC 組織HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達呈正相關（rs=0.626,P＜0.05）。見表4。Bax 與HSP90α 和Bcl-2 表達呈負相關（rs=-0.609 和-0.594,P ＜0.05）。見表5。

表4 NSCLC 組織HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達的相關性

表5 NSCLC 組織Bax 與HSP90α 和Bcl-2 蛋白表達的相關性

3 討論

環境污染、長期吸煙或者家族性的遺傳易感基因的攜帶，均能夠促進NSCLC 的發生，特別是在合并有長期吸煙的男性群體中，NSCLC 的發生風險更高，遠期的臨床轉歸更差［8］。長期的隨訪觀察發現，NSCLC 綜合性治療措施治療后的5年生存率不足40%，遠期的復發率和轉移率可明顯提高［9-10］。免疫靶向性治療能夠在NSCLC 的輔助治療過程中發揮重要的作用，而本次研究對于NSCLC 病灶組織中HSP90α、Bax 和Bcl-2 的探討，不僅能夠為NSCLC 患者的病情評估提供參考，同時還能夠為NSCLC 患者的免疫靶向性治療提供可能的作用靶點。

HSP90α 是熱休克家族相關成員，其能夠通過誘導癌細胞的代謝障礙，促進癌細胞核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）的異常裂變，進而導致惡性腫瘤的發生發展。HSP90α 能夠通過其對于糖蛋白末端的磷酸化修飾作用，導致癌細胞內的G1/S 期比例的異常，提高癌細胞快速跨越G0 期的能力，促進癌細胞的持續性DNA 分裂［11］。基礎方面的研究還認為，HSP90α 的上升能夠導致癌細胞黏附和轉移能力的上升，增加了腫瘤細胞的擴散風險［12］；Bax 是腫瘤凋亡相關因子，其能夠通過影響到Bcl-2/Bax 比值，進而影響癌細胞的增殖和凋亡平衡，提高癌細胞的凋亡比例，增加癌細胞的壞死吸收的速度［13］；Bcl-2 是癌細胞凋亡負性調控因子，其能夠通過形成癌細胞內的磷酸二聚體，進而提高癌細胞的DNA 擴增速度，降低癌細胞的凋亡速度。部分研究者探討了Bax 和Bcl-2 的表達與肺癌的關系，認為二者的表達上升能夠促進肺癌患者臨床分期的進展，加劇肺癌患者臨床預后的惡化［7］，但缺乏對于HSP90α 與Bax或者Bcl-2 的相關關系的分析研究。

本次研究對于肺癌患者病灶組織中HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達分析研究可見，在病例組病灶組織中，HSP90α 及Bcl-2 蛋白的表達陽性率明顯上升，高于對照組，而Bax 蛋白的表達陽性率明顯下降，低于對照組，差異較為明顯，提示HSP90α、Bax 和Bcl-2 的異常表達均能夠參與NSCLC 的病情進展過程。通過匯集不同的相關文獻，筆者認為這主要與HSP90α、Bax 和Bcl-2 的下列幾個方面的作用有關［14］：①HSP90α 的表達上升能夠促進癌細胞DNA 錯配修復能力的下降，導致癌細胞持續性自我增殖速度的提升；②Bax 的表達下降或者Bcl-2 的表達上升，能夠導致癌細胞凋亡信號通路的改變，抑制了癌細胞的凋亡導致癌細胞G0/S 期細胞比例的下降，影響到了癌細胞的增殖和凋亡的平衡。張峻青等［15］研究者也認為，在NSCLC 患者中，HSP90 的表達濃度可平均上升30%以上，特別是在合并有明顯的遠處轉移或者遠期病死率較高的患者中，HSP90 的表達濃度的上升更為明顯。免疫組化染色分析研究可見，在癌細胞異型性較為明顯的區域，HSP90α 和Bcl-2的染色強度較深，提示了相關指標可能影響到了肺癌上皮細胞的異型性。在探討HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達與NSCLC 患者臨床病理特征的關系過程中，已發現在臨床分期較晚或者合并有明顯的淋巴結轉移的患者中，HSP90α 的表達濃度可明顯上升，提示HSP90α 的表達與肺癌患者臨床病理特征密切相關，這主要由于HSP90α 的表達上升能夠提高肺癌細胞浸潤和黏附能力，促進癌細胞的轉移過程；在腫瘤直徑較大的肺癌患者中，Bcl-2的表達濃度明顯地上升，提示Bcl-2 的表達可能影響到了腫瘤病灶組織的增殖或者腫瘤細胞的富集，進而增加了腫瘤直徑；在癌細胞分化程度較差的患者中，Bax 的表達濃度明顯地下降，提示Bcl-2的表達與肺癌患者的臨床病理特征同樣相關，這主要由于Bax 的表達能夠影響到肺癌細胞的分化成熟程度。最后本次研究發現，HSP90α 和Bcl-2蛋白表達呈正相關，而與Bax 呈負相關，提示了3 種蛋白在影響到肺癌的病情進展過程中可能發揮了一定的協同刺激作用。

綜上所述，在NSCLC 患者中，HSP90α 及Bcl-2 的表達明顯上升，而Bax 的表達明顯下降，同時HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達與肺癌患者的臨床病理特征密切相關。后續相關臨床研究可以探討HSP90α、Bax 和Bcl-2 的表達與肺癌患者臨床預后的關系。