溫度、pH值對離體模型中肌原纖維蛋白去磷酸化反應的影響

任 馳，侯成立，李 欣，擺玉薔，張德權*

（中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

肌原纖維蛋白占宰后肉中蛋白總量的55%～60%，是肌細胞骨架的重要組成部分，與肌肉收縮密切相關，影響宰后肉嫩度[1-2]。蛋白質磷酸化修飾是最為普遍且重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式[3-6]，在不同嫩度、色澤、pH值下降速率或基因型的宰后肉中鑒定到許多磷酸化蛋白質[7-10]，肌原纖維蛋白存在磷酸化修飾現象[3]。蛋白質磷酸化反應可逆，經磷酸酶催化發生去磷酸化反應。堿性磷酸酶是普遍存在的一種磷酸酶，可對底物分子起到去磷酸化作用[11-13]，在醫學、免疫學、生物化學和分子生物學等領域應用廣泛[14]。研究表明當宰后肉中蛋白質發生去磷酸化修飾后會正向影響嫩度、肉色等品質[11,15]，通過控制堿性磷酸酶活性降低蛋白質磷酸化水平是一種潛在的方法。酶活性主要受溫度和pH值影響，宰后肉在成熟過程中在不同溫度下加工、貯藏、運輸、銷售，而且隨著成熟時間延長pH值會逐漸降低到極限pH值后略微回升。因此本實驗設置3 個溫度及3 個pH值，分別為25（室溫）、15 ℃（車間溫度）和4 ℃（冷藏溫度），pH 5.2（極限pH值）、pH 5.8（介于極限pH值和pH45min的中間pH值）和pH 6.4（pH45min）。通過測定不同溫度和pH值條件下酶活性變化及肌原纖維蛋白磷酸化水平變化，明確堿性磷酸酶活性變化規律及其催化去磷酸化反應的能力，為改善和保持宰后肉品質提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇生長環境一致、飼養條件相同且體質量和月齡相近的小尾寒羊與本地羊雜交公羊（7 月齡），屠宰后立即取下雙側背最長肌（n=3），剔除明顯可見的脂肪與筋膜，切成大小均一的肉塊以便后續取樣，待宰后30 min，放入液氮速凍，運回實驗室并保存于－80 ℃。采樣地點為北京二商穆香源清真肉類食品有限公司，采用清真屠宰方式。

堿性磷酸酶活性測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒 美國Thermo公司；蛋白酶抑制劑 德國Roche公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、5’-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、堿性磷酸酶 美國Sigma公司；Pro-Q Diamond染色液、SYPRO Ruby染色液 美國Invitrogen公司；四硼酸鈉、氯化鎂、氯化鉀、甲醇、乙醇、乙酸、乙腈等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ML204/02電子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；FCR1000-UF-E超純水機 青島富勒姆科技有限公司；TS-2型脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EMS-19磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；SpectraMax 190全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；Neofuge高效冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；Research plus微量移液槍 德國Eppendorf公司；MJ-II霉菌培養箱 上海一恒科技有限公司；MSC-100恒溫混勻儀 杭州奧盛儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System電泳設備、ChemiDocTMMP凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白提取

參考Huang Honggang等[16]的方法略作修改，取1 g羊背最長肌樣品，加入5 mL預冷的肌漿蛋白提取液（0.039 mol/L四硼酸鈉，0.025 mol/L KCl，5 mmol/L EGTA，蛋白酶抑制劑），冰浴勻漿15 s（1 200 r/min，勻漿4 次，間隔30 s），將所得勻漿配平后在2 000×g、4 ℃條件下離心15 min，待離心結束后棄掉上清液，在所得沉淀中加入5 mL洗滌液（100 mmol/L KCl，1.0% Triton X-100），在2 000×g、4 ℃離心15 min（2 次）以除去多余肌漿蛋白，棄掉上清液，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。在肌原纖維蛋白沉淀中加入10 mL肌原纖維蛋白溶解液（0.4 mol/L KCl、50 mmol/L Tris、1.0 mmol/L DTT），冰浴勻漿15 s。得到的肌原纖維蛋白溶液用BCA法測定蛋白濃度，并保存于－80 ℃。

1.3.2 肌原纖維蛋白孵育

取肌原纖維蛋白溶液，加入堿性磷酸酶純品（25 U/100 g）建立堿性磷酸酶處理組（AP組），對照組（C組）為不添加堿性磷酸酶的肌原纖維蛋白溶液。孵育條件：25 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時間10 min、30 min、1 h、2 h、4 h；15 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時間30 min、2 h、4 h、12 h、1 d；4 ℃，pH 5.2、5.8、6.4，孵育時間30 min、4 h、12 h、1 d、2 d、4 d。在每個時間點留樣，液氮速凍并保存于－80 ℃。

1.3.3 磷酸化水平測定

參照文獻[8,16-18]的方法進行肌原纖維蛋白磷酸化水平和堿性磷酸酶磷酸化水平的測定。將50 μL的肌原纖維蛋白溶液與等體積的100 μL上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、pH 6.8、40 g/L SDS、1 g/L溴酚藍、250 g/L甘油）混合，沸水浴中煮沸5 min，冷卻后12 000×g、離心2 min，上清液即為電泳上樣樣品。電泳采用的分離膠為12%，濃縮膠為4%，上樣量5 μg，每個蛋白樣品重復4 次。設置初始電壓70 V，當溴酚藍進入分離膠后調至電壓110 V，待溴酚藍跑出分離膠后關閉電源。

電泳結束后，卸下凝膠用固定液（10%乙酸、50%甲醇）固定2 次（30 min/次），水洗3 次（10 min），Pro-Q Diamond染液避光慢搖70 min進行磷酸化蛋白染色，染色完畢后用Pro-Q脫色液（20%乙腈，50 mmol/L乙酸鈉，pH 4.0）脫色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝膠成像系統對磷酸化蛋白進行圖像掃描。待圖像掃描后，用SYPRO Ruby染液避光慢搖5 h進行全蛋白染色，染色完畢后用Ruby脫色液（7%乙酸、10%乙醇）脫色2 次（30 min/次），水洗3 次（5 min），采用ChemiDocTMMP凝膠成像系統對全蛋白進行圖像掃描。經Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色后的凝膠在掃描時，激發波長（532 nm）和分辨率（200 mm）一致，但Pro-Q Diamond染色凝膠的發射波長為580 nm，而SYPRO Ruby染色凝膠的發射波長為610 nm[19]。Pro-Q染色后的光密度值（P）和Ruby染色后的光密度值（T）可以采用Quantity One 4.6.2軟件進行分析[20]。P/T是計算蛋白質磷酸化水平的一種半定量分析[21]，可以衡量肌原纖維蛋白磷酸化水平和堿性磷酸酶磷酸化水平的變化。用對照組25 ℃孵育0 min時的樣品作為標樣，消除不同凝膠電泳及染色的差異。

1.3.4 堿性磷酸酶活性測定

采用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒（貨號A059-2）測定AP組的堿性磷酸酶活性。樣品稀釋1 440 倍后，按照試劑盒說明進行試劑配制，建立反應體系，充分混勻后在不同的孵育溫度（25、15、4 ℃）反應15 min，加入顯色液，輕輕振搖孔板混勻，用酶標儀在波長520 nm處測定吸光度，平行4 次。堿性磷酸酶活性計算公式如下：

1.4 數據統計分析

用SPSS Statistic 21.0軟件進行數據分析。肌原纖維蛋白磷酸化水平、堿性磷酸酶磷酸化水平、堿性磷酸酶活性用獨立樣本T檢驗和鄧肯多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，結果用表示。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白磷酸化水平

圖1 不同溫度、pH值孵育Pro-Q染色和Ruby染色圖Fig. 1 Pro-Q and Ruby staining images of SDS-PAGE gels at different temperatures and pH values

通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光染色分析不同溫度、pH值條件下隨著孵育時間延長肌原纖維蛋白磷酸化水平變化，結果如圖1、2所示。從圖1中選取10 個清晰且明顯可見的電泳條帶進行光密度分析，每個時間點Pro-Q染色10 個條帶光密度的和（P）與Ruby染色10 個條帶光密度的和（T）之比為肌原纖維蛋白磷酸化水平。

圖2 不同溫度、pH值孵育肌原纖維蛋白磷酸化水平Fig. 2 Phosphorylation levels of myofibrillar protein at different temperatures and pH values

蛋白質經磷酸酶催化可以發生去磷酸化反應，降低蛋白質磷酸化水平[22-24]。由圖2可知，隨著孵育時間的延長，在不同溫度和pH值條件下C組的肌原纖維蛋白磷酸化水平均無顯著變化（P＞0.05），說明不添加堿性磷酸酶的肌原纖維蛋白在孵育過程中不發生去磷酸化反應。pH 6.4條件下，25 ℃孵育4 h AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平為0.72，顯著低于此時C組肌原纖維蛋白磷酸化水平0.95（P＜0.05）；15 ℃每個孵育時間AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平（P＜0.05）；4 ℃孵育4 d AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平為0.96，顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平1.13（P＜0.05），說明在pH 6.4時溫度高有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應。pH 5.8條件下，25、15、4 ℃孵育4 h、1 d、4 d AP組肌原纖維蛋白磷酸化水平分別為0.78、0.83、0.95，顯著低于C組肌原纖維蛋白磷酸化水平0.99、0.97、1.16（P＜0.05），說明pH 5.8時溫度高同樣有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應。pH 5.2條件下，不同溫度AP組的肌原纖維蛋白磷酸化水平也未發生顯著變化（P＞0.05），說明pH 5.2條件下堿性磷酸酶活性被抑制。對比相同溫度不同pH值結果表明，pH值高有利于堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應。

綜上，堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化反應受溫度和pH值的共同調控，但當溫度或pH值中某一因素更加偏離堿性磷酸酶發揮最大活性的條件時，會成為影響堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化反應的限制因素。

2.2 堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶來源不同其理化性質也存在一些差異[25]，堿性磷酸酶發揮活性的最適pH值在9～10左右，最適溫度在40 ℃左右[26-30]。如圖3所示，隨著孵育時間的延長堿性磷酸酶活性逐漸下降。25 ℃，pH 5.8和pH 6.4孵育1～4 h的堿性磷酸酶活性為15 103.03～16 123.91 U/L，顯著大于pH 5.2孵育1～4 h的堿性磷酸酶活性（P＜0.05），說明25 ℃、pH 5.2抑制堿性磷酸酶活性，使得此條件下堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發生去磷酸化程度低，肌原纖維蛋白磷酸化水平較對照組無顯著變化（P＞0.05）。15 ℃，pH 6.4孵育30 min、12 h、1 d堿性磷酸酶活性顯著大于pH 5.2和pH 5.8孵育30 min、12 h、1 d堿性磷酸酶活性（P＜0.05），說明當溫度下降時，pH值降低對堿性磷酸酶活性的抑制作用增強。4 ℃、pH 5.2條件下，堿性磷酸酶活性在孵育至第2天時最高為12 889.27 U/L，說明隨著孵育時間延長，4 ℃、pH 5.2的條件對堿性磷酸酶活性抑制作用會隨著孵育時間延長而減弱。

比較不同溫度下，同一pH值和孵育時間的堿性磷酸酶活性，如圖3所示，在同一pH值和孵育時間下，溫度降低抑制堿性磷酸酶活性，說明溫度偏離堿性磷酸酶最適溫度越大對堿性磷酸酶活性抑制越強。但15 ℃、pH 5.8孵育2 h和4 h以及15 ℃、pH 6.4孵育30 min的堿性磷酸酶活性稍大于25 ℃同樣條件下的堿性磷酸酶活性，說明此條件下25 ℃和15 ℃對堿性磷酸酶活性抑制作用相差不大。

圖3 不同溫度、pH值孵育堿性磷酸酶活性Fig. 3 AP activities at different temperatures and pH values

2.3 堿性磷酸酶磷酸化水平

圖4 不同溫度、pH值孵育堿性磷酸酶磷酸化水平Fig. 4 Phosphorylation levels of AP at different temperatures and pH values

本實驗中所用的堿性磷酸酶（貨號P0114）分子質量為140～160 kDa。堿性磷酸酶是一種同源二聚體磷酸單酯酶，在制備用于電泳樣品時會使堿性磷酸酶發生變性，二聚體解體后分子質量約為70 kDa[30]，如圖1 AP條帶所示。在孵育過程中堿性磷酸酶磷酸化水平出現顯著變化，結果如圖4所示。隨著孵育時間延長，不同溫度和pH值條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平逐漸下降，說明堿性磷酸酶不僅可以催化孵育體系中的肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應，也能催化其自身發生去磷酸化反應。25 ℃孵育10 min時pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），15 ℃孵育30 min pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），而4 ℃孵育4 h pH 5.2和pH 6.4條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平差異顯著（P＜0.05），說明溫度升高會使堿性磷酸酶催化其自身發生去磷酸化反應的時間提前。不同溫度在孵育后期pH 5.2條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平顯著高于另外2 個pH值條件下的堿性磷酸酶磷酸化水平（P＜0.05），說明即使溫度升高，pH 5.2對堿性磷酸酶催化其自身發生去磷酸化反應的抑制作用也更強烈。這是由于pH 5.2對堿性磷酸酶活性抑制作用明顯。通過比較不同溫度和pH值條件下的堿性磷酸酶活性與堿性磷酸酶磷酸化水平發現，限制堿性磷酸酶活性變化的主要因素是溫度和pH值。當堿性磷酸酶發生去磷酸化后，其活性會略微下降，但影響堿性磷酸酶活性的因素主要是溫度和pH值。

3 討 論

磷酸化修飾是一種普遍的蛋白質翻譯后修飾方式，近年研究表明宰后肌肉中存在蛋白質磷酸化修飾，并對肉品質的形成產生一定影響[20,31]。蛋白質磷酸化反應是一種可逆反應，在磷酸酶的催化下會發生去磷酸化反應，降低蛋白質磷酸化水平。有研究表明，堿性磷酸酶活性受溫度和pH值的影響[25]，進而影響到其催化去磷酸化反應的能力。本研究結果表明堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應，肌原纖維蛋白磷酸化水平降低，與前人研究結果一致[15,32]。本研究發現隨著孵育溫度和pH值的升高，肌原纖維蛋白發生去磷酸化反應的程度增大，時間提前，這可能和堿性磷酸酶活性受到不同溫度和pH值的影響有關。Bortolato等[33]研究表明，低溫下酸性pH值會抑制堿性磷酸酶活性，這與本研究溫度、pH值越低堿性磷酸酶活性越小相一致。pH 5.2接近宰后肉的極限pH值[34]，在此條件下即使孵育溫度升高堿性磷酸酶也不能顯著降低肌原纖維蛋白磷酸化水平，說明此時堿性磷酸酶活性已被抑制。本團隊研究表明[35]，宰后羊肉在4 ℃貯藏磷酸化水平先升高后逐漸降低，并在貯藏5 d時達到穩定，這可能是因為宰后ATP消耗殆盡，磷酸化反應結束，而達到極限pH值后，去磷酸化反應受抑制，故磷酸化水平逐漸穩定。前人研究表明，堿性磷酸酶長時間處于pH 3.4或40～70 ℃的條件會使α-螺旋受到破壞，二級結構逐漸消失，發生不可逆的失活[36]。

通過分析堿性磷酸酶的磷酸化水平，發現堿性磷酸酶可以催化自身發生去磷酸化反應，這可能與堿性磷酸酶是一種非特異性酶有關[30]。本研究發現，堿性磷酸酶磷酸化水平變化趨勢比堿性磷酸酶活性和肌原纖維蛋白磷酸化水平明顯，說明當堿性磷酸酶自身發生去磷酸化后，對堿性磷酸酶活性沒有決定性影響。例如，在pH 5.2條件下，3 個溫度孵育時堿性磷酸酶磷酸化水平均變化顯著，但堿性磷酸酶活性變化相對穩定，肌原纖維蛋白磷酸化水平較對照組無顯著變化。推測堿性磷酸酶自身發生去磷酸化對其二級結構的影響小于溫度和pH值，這有待進一步驗證。

4 結 論

本研究發現堿性磷酸酶不僅可以催化其他蛋白發生去磷酸化，也可以催化其自身發生去磷酸化。而且當堿性磷酸酶自身去磷酸化后，對堿性磷酸酶活性影響較小，影響堿性磷酸酶活性的因素主要是溫度和pH值。當pH值較低時，堿性磷酸酶活性被抑制程度高，不能降低肌原纖維蛋白磷酸化水平。在一定范圍內，溫度和pH值升高可以使堿性磷酸酶催化肌原纖維蛋白去磷酸化能力增強，作用時間提前，這為通過降低宰后肉中磷酸化水平而改善肉部分食用品質提供理論依據。