TLC-UPLC-MS/MS 法檢測網紅保健品中非法添加的8 種化學藥物

曹曉琴，方振峰，張 濤，周國勇，陳中強，施 璐*

（江漢大學醫學院，湖北 武漢 430056）

目前，一些不法廠商為謀取經濟利益，盲目追求療效，在網絡銷售的保健食品中非法添加化學藥物，變“禁藥”成“網紅藥”，嚴重危害人民群眾的生命健康安全[1]。其中，酚酞和西布曲明是網紅減肥藥中常見的添加物[2-3]，一些商家還將麻黃堿和咖啡因聯合作為減肥的輔助藥物添加[4-5]；西地那非是網紅補腎壯陽類保健品中常見的添加物[6]；洛伐他汀和辛伐他汀是網紅降脂類保健品中常見的添加物[7]；苯乙雙胍是網紅降糖類保健品中常見的添加物[8]。同時，日常檢驗過程中，還發現一些減肥類、降血脂類和潤腸通便類保健食品在功能宣稱和非法添加的藥物類型上往往具有交叉，既能迅速達到所宣稱的功效，又規避了非法添加化學藥物的檢測[9-10]，而網售藥品和保健品作為一種新生事物，監管體系還不健全，因此急需針對網紅保健品建立全面有效的檢測方法，打擊網上“多種類”、隱蔽性強的非法添加行為。

目前，保健品中非法添加西藥的常用檢測方法有薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法[11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-14]、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法[15-16]、顯微傅里葉變換紅外光譜（micro fourier transform infrared spectroscopy，Micro FTIR）法[17]、表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman spectroscopy，SERS）法[18]、高效液相色譜-串聯質譜聯用（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[19-21]等。TLC和HPLC由于儀器性能限制問題，靈敏度低，容易造成假陽性的結果[11]。UPLC比傳統的液相色譜具有更高的分辨率和更快的分析速度，但是無法做到定量確證[15]，HPLC-MS/MS法是目前監測非法添加的有力工具，但是，文獻調研發現，大部分監測的對象僅集中在各自的小類里[22-23]，而非法添加的網紅保健品為達到宣稱的功能療效，在非法添加的藥物類型上往往具有交叉，大大增加了檢測的難度。因此，本研究依據相關報道[24-26]，選取了8 種具有減肥、降脂、通便功能的代表性藥物，同時也是從網紅商家處方便易得的一些代表性藥物，采用UPLC-MS/MS法進行檢測。在前處理過程中，大部分文獻采取用甲醇或乙腈直接提取的方式進行前處理[15,21]，對一些復雜的基質并沒有進行針對性的處理，只是采用過濾膜去除雜質干擾[24-26]。也有研究為避免基質干擾，采用固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）進行前處理，但是操作過程復雜，成本較高[27-29]。

本研究將TLC法應用到樣品前處理中，不僅避免了常規有機試劑提取方法容易造成干擾大、漏檢、假陰性的結果[9-11]，也摒棄了文獻采用SPE法前處理成本高、較為復雜且不適合大量篩查的缺點[28-29]，同時可以做到操作簡單，結果準確。針對網紅保健食品中非法添加化學成分檢測方法的缺失和標準落后的情況，本實驗將TLC法應用到樣品前處理過程中，再聯用高靈敏度、高專一性的UPLC-MS/MS法，擬建立同時檢測網紅保健品中非法添加8 種不同類別的藥物（西布曲明、洛伐他汀、辛伐他汀、麻黃堿、咖啡因、酚酞、苯乙雙胍和西地那非）的TLC-UPLC-MS/MS方法。并采用該方法對市售45 種網紅保健食品進行檢測，以期為打擊非法添加、藥品監管及規范網絡市場提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸西布曲明（純度99.7%）、洛伐他汀（純度99.4%）、辛伐他汀（純度99.0%）、鹽酸麻黃堿（純度99.7%）、咖啡因（純度99.9%）、酚酞（純度99.9%）、鹽酸苯乙雙胍（純度99.7%） 中國食品藥品檢定研究院；枸櫞酸西地那非（純度99.5%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸、乙酸銨、乙酸（均為色譜純） 美國Fisher Chemicals公司；去離子水為Millipore公司超純水器制備；氯仿、氨水、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）、羧甲基纖維素鈉（批號：20161220） 國藥集團化學試劑有限公司；GF254薄層硅膠板（200 mm×100 mm） 青島海浪硅膠干燥劑廠。

45 批保健食品樣品均來自網購。

1.2 儀器與設備

API 4500三重四極桿MS/MS 美國Applied Biosystems公司；UPLC 日本Shimadzu公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；離心機 湖南湘立科學有限公司；Kinetex 100 RP-18色譜柱 美國Phenomenex公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min。流動相梯度見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient program of UPLC

1.3.2 質譜條件

結合文獻[19-21]報道，本研究分別采用乙腈-水、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、0.2 mmol/L乙酸-乙腈的溶劑體系（50∶50，V/V）配制10 μg/L的標準溶液，依次進行質譜條件的選擇。采用參數分別為：離子源：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源；掃描方式：正離子模式進行掃描；氣簾氣15 psi；霧化氣（Gas1）：55 psi；輔助氣（Gas2）：50 psi；離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；在多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）狀態下，通過優化離子對的碰撞能量和去簇電壓值，得到各目標化合物的質譜參數見表2。

表2 8 種藥物在MRM模式下的母離子和子離子信息Table 2 Precursor/daughter ions information of the 8 drugs in the MRM mode

1.3.3 對照品溶液的制備

標準對照品貯備液的配制：精密稱取各對照品10.0 mg，用10 mL甲醇溶解、定容，分別制成質量濃度為1.0 mg/mL標準貯備液，－20 ℃避光保存。

混合對照品標準工作液的配制：精密量取標準貯備液各0.1 mL，加入空白樣品提取液中，定容到10 mL，制成質量濃度為10.0 μg/mL的混合標準工作液，4 ℃避光保存。

1.3.4 供試品的制備

片劑：隨機取同一批號的供試品20 片，研細為試樣；硬膠囊：隨機取同一批號的供試品20 粒，傾出所有內容物，研細為試樣；軟膠囊：隨機取同一批號的供試品20 粒，將內容物全部擠到同一離心管中，充分混勻后，作為試樣；口服溶液劑：隨機取同一批號的供試品10 支（瓶），取等量體積樣品到同一容器中混勻，作為試樣；其他固體類樣品（餅干、糖果、粉末、茶劑）：隨機取同一批號的供試品10 份，研細或粉碎為試樣。

稱取上述處理好的試樣約1.0 g，置于5 mL離心管中，加入2 mL甲醇，超聲提取（功率143 W；頻率40 kHz）15 min后，4 000 r/min離心5 min，取上清液作為供試品溶液。

所有采集的樣品均采用建立的檢測方法進行空白基質的篩選，測定結果為無任何干擾峰的基質作為空白基質，用于樣品添加實驗。

1.3.5 前處理條件

本研究采用直接提取法、SPE法和TLC法分別進行實驗。

直接提取法采用文獻[21]方法，稱取1.3.4節處理好的試樣約1.0 g，置于5 mL 離心管中，加入2 mL甲醇，超聲提取（功率143 W；頻率40 kHz）15 min后，4 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜上機檢測。

SPE法參考文獻[28-29]方法，采用Waters Oasis HLB SPE小柱1 mL/30 mg，依次加入甲醇3 mL和水3 mL活化后，經1.3.4節制備好的供試品溶液上樣，再用甲醇-水（50∶50，V/V）3 mL淋洗，抽干后，用甲醇3 mL洗脫，收集洗脫液。氮氣吹干，1 mL流動相復溶，過0.22 μm 濾膜，續濾液作為供試品溶液。

TLC法在文獻[17-18]基礎上進行適當調整，以硅膠GF254薄層板為固定相，以氯仿-甲醇-氨水（11∶1∶0.1，V/V）為展開劑，取制備好的供試品溶液點于薄層板上，點樣量為0.5 mL，展開后取出晾干，在紫外燈254 nm下檢視定位。將顯色的薄層挖下來放入1.5 mL EP管中，將薄層粉末連同EP管一同烘干后，用0.5 mL的甲醇溶解，超聲 5 min、高速離心3～5 min，取上清液，過濾膜上機檢測。

1.3.6 定量測定

空白樣品提取液中加入1.3.3節制備的對照品溶液制成混合標準溶液，在1.3.1節和1.3.2節的色譜和質譜條件下進樣分析，以各目標物質的響應信號強度y為縱坐標，對應藥物的濃度為橫坐標繪制標準工作曲線。樣品溶液中各待測藥物響應值均應在測定的線性范圍內。

1.4 統計學分析

在優化條件和實際樣品測定時，平行實驗重復操作6 次，并采用SPSS 13.0（Chicago, IL, USA）統計軟件分析。基質效應通過t檢驗考察[30]。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

圖1 部分藥物的二級質譜圖Fig. 1 Mass spectra of selected drugs

質譜條件選擇時，ESI的正負離子模式均被評估，結果發現，待測物均可選擇[M＋H]＋離子作為母離子。這與許立等[9]報道一致。而洛伐他汀和辛伐他汀很容易加和成[M＋Na]＋模式，而且響應很高，但其二級碎片離子穩定性較差，而響應較弱的[M＋H]＋模式在MRM下取得較好的響應，而且比較穩定，因此選擇[M＋H]＋模式，這與宮旭等[21]報道的一致。根據馬微[3]和李濤[4]等報道，酚酞采用正負離子模式都可檢測，馬微等[3]認為正離子響應高于負離子模式，但是本研究發現負離子的質譜響應信號高于正離子模式下的響應。在與其他藥物同時檢測時，采用正負離子同時掃描的模式，響應值明顯低于正離子掃描模式。所以綜合考慮，在流動相中加入10 mmol/L乙酸銨溶液，使得正離子條件下的酚酞也獲得了較高的靈敏度，形成m/z 319的[M＋H]＋的準分子離子峰。對于結構相似的物質如洛伐他汀和辛伐他汀，裂解成相同的子離子，但通過離子對的組合，可以實現良好的分離。總之，通過優化各自的離子對，所有待測藥物都選擇了合適的母離子和子離子，部分藥物的二級質譜圖見圖1。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

根據文獻報道[20-22]，結合選定的目標化合物的性質，分別考察了Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters BEH Shield RP-18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱、Kinetex 100 RP-18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）等。結果表明Agilent Eclipse Plus C18柱分離時整體出峰較好，但麻黃堿、咖啡因色譜峰出現拖尾；Waters BEH Shield RP-18柱適合分離堿性強的物質，因此麻黃堿、咖啡因峰形更尖銳對稱，但是分離時酚酞和苯乙雙胍峰不能分離；Kinetex 100 RP-18柱對8 個物質都能完全分離，各峰峰形也很尖銳對稱，分析時間較短。綜合考慮，最終選擇Kinetex 100 RP-18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）為本實驗的色譜柱。

2.2.2 流動相

對于反相色譜，通常采用甲醇-水、乙腈-水等二元溶劑體系作為流動相進行實驗，根據許立等[9]報道，正離子掃描的模式通常采用甲酸增強儀器響應，但是也有文獻采用加入不同比例的甲酸銨或乙酸銨取得很好的效果[21]。所以本研究分別比較了不同的溶劑配比對分離效果的影響，流動相中依次加入甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等離子化試劑進行流動相的選擇。結果發現：以不同體積比的乙腈-水為流動相時待測物的儀器響應信號高于同比例的甲醇-水為流動相。流動相中加入乙酸銨可改善待測物的分離與峰形，正離子模式中加入甲酸可顯著提高待測物電離效果。這與許立等[9]的結果一致。所以最終選定乙腈和1 mmol/L乙酸銨（含1%乙酸）溶液作為流動相。在選定的流動相下各組分獲得良好的分離，通過優化梯度洗脫程序，將不同極性的待測物的檢測時間縮短為10 min。8 種待測物的總離子流圖見圖2。

圖2 8 種待測物的總離子流圖（6～16 μg/L）Fig. 2 Total ion current chromatograms of the 8 compounds (6–16 μg/L)

2.2.3 柱溫的選擇

考察15、25、35、45 ℃ 4 種不同柱溫對分離度的影響。通過比較發現在4 種溫度條件下，分析總時間相差不大，但是在15 ℃時，洛伐他汀和辛伐他汀分離度下降，兩峰會部分重疊。當柱溫大于40 ℃時，苯乙雙胍峰和酚酞峰因保留時間間隔縮短而未能分離，從而兩種物質合為一個色譜強峰。柱溫35 ℃時的實驗結果最佳（圖3）。因此本實驗柱溫最終定為35 ℃。

圖3 標準溶液中8 種化合物的定量色譜圖（0.6～1.6 μg/L）Fig. 3 Quantitative chromatograms of standard solutions of the 8 compounds (0.6–1.6 μg/L)

2.3 前處理方法的選擇

直接提取法和SPE法分別參考文獻[21]和文獻[17-18]進行實驗（如1.3.5節所述）。TLC法在文獻[17-18]的基礎上，對展開劑進行了優化，分別考察氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸（9∶2∶1∶0.5，V/V）和氯仿-甲醇-氨水（11∶1∶0.1，V/V）的展開效果，結果無明顯差異。考慮到配比的方便，最終確定采用的是氯仿-甲醇-氨水（11∶1∶0.1，V/V）作為展開劑（具體步驟見1.3.5節）。

對3 種提取方法的提取效果進行詳細比較，直接提取方法操作簡單快速，但是稀釋了藥物的濃度，會影響測定的靈敏度，而且對于一些復雜的樣品基質，只進行簡單的提取，未經凈化，上機樣液雜質較多，容易導致色譜柱壓力波動，影響保留時間定性，影響數據的準確性，而且極易污染離子源和檢測器[27]。SPE法在提取后進行了凈化，采用SPE小柱進一步對樣品進行處理，消除了基質干擾，但是SPE成本高且操作較為復雜。此外文獻認為SPE會降低方法的回收率[27]。所以本研究將色譜分析中的TLC法應用到樣品前處理中，既避免了傳統的液液萃取法容易造成干擾大、漏檢、假陰性的結果，也摒棄了SPE成本高且較為復雜的方式。通過對3 種提取方法提取回收率的比較（表3），結果顯示，采用TLC法前處理與SPE法取得同樣的提取效果，明顯優于傳統的直接提取法，但TLC法比SPE法成本更低，操作更簡單，更易于實現大規模的檢測，最終本實驗采用TLC進行前處理取得較好的效果。

表3 3 種不同的前處理方法比較Table 3 Comparison of three extraction techniques

2.4 方法學考察結果

2.4.1 基質效應考察結果

采用t檢驗考察基質效應[30]。經實驗得出8 種藥品在不同基質中的t值均大于2.4。所以，本研究采用基質匹配工作曲線進行定量。

2.4.2 檢出限、定量限及線性范圍

本研究在文獻[20-22]的基礎上，利用配制成的空白樣品中加入混合標準溶液，按0.5、1.0、5.0、10、50、100 μg/L的水平添加，進樣檢測，繪制標準工作曲線。以峰面積Y對進樣質量濃度X進行線性回歸，以RSN為3計算檢出限，以RSN為10計算定量限）。由表4可知，8 種藥物在質量濃度0.5～100 μg/L范圍內，線性關系良好，各組分的檢出限在0.09～0.29 μg/kg之間，定量限在0.31～0.79 μg/kg之間。

表4 8 種待測藥物的線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限Table 4 Regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantization for the 8 drugs

2.4.3 準確度和精密度結果

準確度用回收率表示，分別在3 個質量濃度水平上添加（1、2、4 倍定量限）。UPLC-MS/MS方法的專屬性非常強，同類型樣品基質的干擾可忽略，因此，本研究選取膠囊劑和口服液和其他固體制劑的代表粉末劑分別做回收率實驗。如表5所示，對于膠囊劑和粉末劑，取其中陰性樣品（12號），稱取1 g樣品，精密加入對照品儲備溶液，最終使試樣中西布曲明、洛伐他汀、麻黃堿、咖啡因含量0.5、1.0、2.0 μg/kg；辛伐他汀和西地那非含量為0.3、0.6、1.2 μg/kg，酚酞和苯乙雙胍含量為0.8、1.6、3.2 μg/kg。對于口服液，取其中陰性樣品（8號），量取1 mL樣品，精密加入對照品儲備溶液，最終使試樣中西布曲明、洛伐他汀、麻黃堿、咖啡因含量為0.5、1.0、2.0 μg/kg；辛伐他汀和西地那非含量為0.3、0.6、1.2 μg/kg，酚酞和苯乙雙胍含量為0.8、1.6、3.2 μg/kg。對于軟膠囊劑，取其中陰性樣品（43號），稱取1 g樣品，精密加入對照品儲備溶液，最終使試樣中西布曲明、洛伐他汀、麻黃堿、咖啡因含量為1.0、2.0、4.0 μg/kg；辛伐他汀和西地那非含量為0.5、1.0、2.0 μg/kg，酚酞和苯乙雙胍含量為1.5、3.0、6.0 μg/kg。

按照前面優化的前處理方法和分析測定方法操作，每個含量樣品重復5 次，通過連續5 d進行同樣實驗，以回收率表示方法的準確度，變異系數表示方法的精密度。不同樣品中添加8 種藥物的回收率及變異系數見表5，分析數據可知待測物在不同樣品中的平均回收率介于67.3%～101.1%，變異系數≤16.5%，這些數據均符合分析方法標準對準確度和精密度的要求。

表5 不同樣品中添加8 種藥物回收率和變異系數Table 5 Recoveries and coefficients of variation for the 8 drugs from different spiked samples

2.5 樣品測定結果

取網購保健食品樣品，按1.3節制備方法制備，分別進樣測定，根據定量監測離子對的離子流圖中色譜峰面積，采用外標法計算樣品中各化學成分的量。排除目標藥物是由處方成分引入的，最后判定樣品中是否含有非法添加的藥物。

表6 45種網購樣品中8 種待測藥物的分析結果（n=6）Table 6 Results of detection of 8 drugs in 45 real samples (n= 6)

表6結果表明，45 批保健食品樣品中25 批樣品檢出含有目標藥物。通過與樣品相應的成分進行比對，其中2 批樣品中所檢出的目標藥物與處方固有成分一致，分別為疏通茶和綠茶肉堿膠囊檢出咖啡因。因為茶葉中會有一定量的咖啡因，不屬于非法添加；另外23 批樣品檢出的目標化合物均不屬于處方所標示的成分，確定為非法添加陽性樣品，采用2.5節線性方程計算其中非法添加藥物的含量，結果表明：檢出率較高的是西布曲明（21 批，含量為0.6～53.1 mg/g），酚酞（5 批，含量為2.2～6.6 mg/g），咖啡因和西地那非分別有1 批。

3 結 論

本研究建立了TLC-UPLC-MS/MS法檢測網紅保健品中非法添加的8 種化學藥物的檢測方法。根據方法學考察結果，本方法專屬性強，靈敏度高，可作為非法摻入化學成分的有效檢測方法。通過對網購的45 種網紅保健品進行檢測，為打擊網絡非法添加，規范保健品市場，提供了技術支持。