霉菌檢測中封閉式培養方法的建立和應用

韓 濤，楊雪妮，張 芳

（1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350108）

霉菌是絲狀真菌的統稱，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染。食品中污染的霉菌不僅能破壞其基質的結構，造成食物的營養損耗以及每年達數十億元的經濟損失[4]；而且通過代謝會產生有害毒素[5-11]，從而造成健康危害[12-18]，因此，是否污染霉菌是評判食品品質的重要指標之一。近年來，世界各國紛紛制訂食品中霉菌的各種限量標準，同時加強霉菌檢測技術的研究。

我國先后5 次修訂了食品中霉菌計數的方法標準[19-23]，據此我國各級監督檢測機構全面開展食品中霉菌的檢測工作，但是檢測中霉菌培養物被污染的現象頻發，這主要是因為每個疏松干燥絨毛狀的霉菌菌落可產生數量巨大的孢子，同時霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強等特點，任何一個孢子在適宜條件下都能發展成新的個體。常規霉菌檢測的培養過程中、以及觀察霉菌菌落時培養皿的移動過程中，不可避免地造成空氣流動，霉菌孢子可趁機飄散進入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴重的交叉污染和外部侵染，對霉菌檢測的質量控制形成嚴峻的考驗。而目前這一常見且棘手的問題始終困擾著相關人員，且無有效的控制措施。

生物體的封閉式培養是指將目標培養物利用特定的設施隔離于相對獨立的微環境中，以進行培養的一種技術，因其具有良好的溫度和濕度控制、污染防護等優點，而在植物的無土槽培、單細胞藻類的快速培養等領域得到廣泛應用[24-25]。如果將封閉式培養方法應用于霉菌的檢測，特定的隔離設施可以將目標培養物隔離以形成霉菌生長的相對獨立的微環境，進而有效杜絕霉菌孢子的擴散污染，但是封閉式培養的微環境中氧氣含量是不可忽視的問題，因為培養過程中充足的氧氣供給是霉菌正常生長發育的基礎，在通風良好的培養環境中，空氣中的氧氣（體積分數21%）可滿足霉菌的需求，但是如果培養環境氧氣體積分數太低，霉菌將停止生長。目前國內外鮮見將封閉式培養方法應用于霉菌檢測的相關報道。

本實驗通過微氧脅迫下黑曲霉的生長動態研究，構建霉菌的封閉式培養方法以防止霉菌孢子的擴散和污染，進一步依托食品中霉菌的檢測分析，比對封閉式培養方法與常規敞開式培養方法的計數結果，探討霉菌檢測過程中封閉式培養方法的可行性和實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus nige，菌株編號：ATCC 16404）購于美國模式培養物集存庫。38 個不同廠家和批號的食品樣品購自福建省福州市幾個不同的超市，包括5 種玉米淀粉、4 種馬鈴薯淀粉、1 種小麥淀粉、8 種紫菜、6 種海苔、5 種桂圓干、2 種紅棗干、1 種枸杞、2 種紙皮核桃、1 種開心果、3 種白曬花生，編號依次為SP1～SP38。

沙氏液體培養基（批號3105358） 廣東環凱微生物科技有限公司；孟加拉紅瓊脂培養基（批號170316）北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌器 日本Hirayamaha公司；微量可調移液器 德國Eppendorf公司；Hfsafe1200生物安全柜 中國上海力申公司；SPX-250B生化培養箱中國上海悅豐儀器儀表有限責任公司；BSA224S分析天平德國賽多利斯集團；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；ZQTY-70振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；Bagmixer 400拍擊式均質器 法國Interscience公司；ADKS-1便攜式氧氣檢測儀 艾特思電子科技有限公司；CVK-UB2超低溫冰箱 日本Sanyo公司；AP-9925抽濾設備 加拿大Autoscience公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌懸液制備

取冷凍保存的黑曲霉標準菌株，接種至無菌沙氏液體培養基中，于200 r/min、28 ℃振蕩培養5 d，再次轉接至沙氏液體培養基活化2 次，之后取菌絲球接種于孟加拉紅培養基平皿，28 ℃培養7 d至孢子大量產生后注入適量無菌生理鹽水，用無菌涂布棒輕輕刮取，使黑曲霉游離于生理鹽水中，再用400 目無菌紗布過濾去除營養菌絲體，收集孢子懸液用血球計數板計數[26]，根據計數結果（未給出）用無菌生理鹽水適當稀釋孢子懸液，以此獲得菌懸液備用（菌懸液經后續實驗測得霉菌菌落數約為2 000 CFU/mL）。

1.3.2 黑曲霉的增殖測試

取1.3.1節制備的菌懸液10 mL至1 300 mL無菌沙氏液體培養基，用拍擊式均質器均質2 min后分裝于13 個梯度（每梯度均設置實驗組和對照組，兩組各設置2 個平行）的離心管中（編號分別為1～13），培養基分裝量分別為56、50、40、30、21、18、17、16、15、14、12、10、5 mL，離心管容積為57 mL，此時13 個梯度的離心管中空氣與培養基體積比分別為0.02∶1、0.14∶1、0.43∶1、0.90∶1、1.71∶1、2.17∶1、2.35∶1、2.56∶1、2.80∶1、3.07∶1、3.75∶1、4.70∶1、10.40∶1。分裝完畢后，旋緊離心管蓋（使離心管處于密封狀態），之后轉移至振蕩培養箱中于200 r/min、28 ℃培養5 d。培養過程中對照組定期做透氣處理（每3 h，于生物安全柜中，將對照組的離心管蓋旋開靜置5 min后旋緊，繼續于200 r/min、28 ℃培養）。實驗組不做透氣處理。

培養結束后將離心管內所有培養物全部抽濾至微孔濾膜（濾膜孔徑為0.45 μm，且事先60 ℃干燥3 h，并稱量質量），再用一片微孔濾膜將培養物覆蓋，并用等體積的無菌超純水沖洗3 次，再次60 ℃干燥3 h后稱量質量，獲得不同離心管黑曲霉增殖的凈質量。

1.3.3 黑曲霉的氧氣消耗性實驗

配制150 mL孟加拉紅培養基于容積為600 mL的均質罐內（均質罐為圓柱形，底面直徑為10 cm），共制備18 個梯度，分別編號為1～18，每個梯度2 個平行，包扎后高壓蒸汽滅菌，待培養基冷卻凝固后備用。梯度1～9為實驗組，分別向均質罐注入1 mL菌懸液（1.3.1節制得），梯度10～18為對照組，不加菌懸液，之后用乳膠膜密封均質罐口，實驗組和對照組于28 ℃培養箱中分別培養0、1、2、3、4、5、7、10、15 d。培養結束后于水下收集均質灌內氣體，并用便攜式氧氣檢測儀測定其氧氣體積分數。

1.3.4 黑曲霉的封閉式培養與敞開式培養的比對測試

將1.3.1節制備的菌懸液采用GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[23]的方法進行霉菌計數，共進行15 個重復，每個重復同時進行2 組獨立的測試，培養時一組采用GB 4789.15—2016[23]中明示的培養方法（即敞開式培養），另一組采用封閉式培養（取1 個無菌空培養皿和1 個凝固的孟加拉紅培養基堆疊放置，共同轉移至1 個無定形自封袋中，排除多余空氣并封口，置于28 ℃恒溫培養箱內培養。此時空氣與培養基的體積之比約為3∶1，自封袋將目標培養皿隔離形成霉菌生長的相對獨立的微環境，可防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，從而杜絕霉菌孢子的擴散污染）。培養5 d后計數平皿的霉菌菌落數。

1.3.5 紫菜中霉菌的重復性測試

對編號為SP14的紫菜樣品進行霉菌計數，共進行9 個重復（編號1～9），每個重復同時進行2 組獨立的測試，且2 組測試在培養時按照1.3.4節的方法分別采用敞開式培養與封閉式培養，培養5 d后計數平皿的霉菌菌落數。

1.3.6 食品中霉菌的比對測試

38 個不同的食品樣品（編號依次為SP1～SP38）按照1.3.4節的方法分2 組分別采用敞開式培養與封閉式培養進行霉菌計數。

1.4 數據分析

食品中霉菌分布不均勻，且消長規律不定，因此在重復測試中數據的差異較大，而常規的再現性標準差以及不確定度評估等方法不適用于霉菌計數結果的比對分析。鑒于實際需要，業內普遍參考標準[27]中r（重復性相關系數）和R（復現性相關系數）兩個參數進行比較評價，本實驗也將R（R=｜lgX－lgY︱）用于分析霉菌敞開式培養和封閉式培養的計數結果的差異。進一步采用SPSS 18.0[28]對兩種培養方法的計數結果進行配對t-檢驗（檢驗水準α=0.05）。同時，用OriginPro 8.0繪圖軟件繪制霉菌增殖曲線和氧氣消耗曲線。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉的增殖測試結果

按照1.3.2節中13 個梯度的測試經過培養、抽濾、干燥、稱質量等步驟后，以空氣與培養基體積比為橫坐標，以霉菌增殖凈質量與培養基體積比（單位為mg/mL）為縱坐標，繪制黑曲霉增殖曲線（圖1）。實驗組的曲線在梯度9（培養基體積15 mL，空氣體積42 mL，空氣與培養基的體積比為2.8∶1）處出現明顯的拐點，此處霉菌生長發生顯著變化。在梯度8～1變化中，離心管中培養基的體積逐漸增多（16～56 mL），而實驗組離心管內的空氣體積下降迅速（41～1 mL），且吻合了黑曲霉增殖凈質量與培養基體積的比值的下降規律，同時對照組的曲線起伏變化不大，而實驗組和對照組的差異僅源自培養過程中氧氣的供給量，因此氧氣是制約實驗組黑曲霉生長增殖的瓶頸，實驗組離心管中空氣體積的降低是黑曲霉增殖量的下降的主要原因。隨著空氣與培養基的體積比值的增大，在體積比達到2.8∶1時，實驗組離心管中氧氣含量可滿足黑曲霉生長的需求，氧氣的限制作用被解除，因此實驗組和對照組梯度9～13黑曲霉的增殖曲線無明顯變化。

所以，對于黑曲霉的封閉式培養，在空氣與培養基的體積比大于2.8∶1的情況下，當培養至第5天時，黑曲霉的生長不受培養微環境中初始空氣體積的限制。

圖1 黑曲霉的增殖曲線Fig. 1 Growth curve of A. niger

2.2 黑曲霉的氧氣消耗性實驗

圖2 黑曲霉的氧氣消耗曲線Fig. 2 Oxygen consumption curve of A. niger

在1.3.3節實驗中，考察黑曲霉在空氣與培養基的體積比為3∶1的條件下，不同培養時間對氧氣的消耗情況。經過接種、培養、測定氧氣體積分數等步驟后，以培養時間為橫坐標，以培養結束后均質罐內氣體的氧氣體積分數為縱坐標，繪制氧氣消耗曲線（圖2）。圖2顯示實驗組（梯度1～9）在培養0～2 d，氧氣消耗緩慢（氧氣體積分數為20.5%左右），此時黑曲霉可能處于“調整期”，其細胞進行代謝調配以適應新的環境，為后期快速增殖做準備；之后，黑曲霉便進入了“對數期”，其細胞快速分裂增殖，同時消耗大量的氧氣，造成了在培養3～7 d的時間內，氧氣體積分數迅速下降（20.5%降至15.2%）；在培養7 d之后，黑曲霉細胞受各方面因素的影響而進入“穩定期”，代謝活動變慢，因此氧氣體積分數下降較慢。而對照組（梯度10～18）的氧氣體積分數維持不變（20.9%），說明培養微環境中氧氣體積分數的變化僅源于黑曲霉細胞的代謝活動。

因此，對于黑曲霉的封閉式培養，在空氣與培養基體積比為3∶1的條件下，當培養至第5天時，氧氣消耗曲線（圖2）未顯示培養微環境中初始空氣體積能顯著影響黑曲霉的增殖。

2.3 黑曲霉封閉式培養與敞開式培養的比對

統計1.3.4節中1∶100稀釋度的孟加拉紅平皿的霉菌菌落數，并計算兩個平行培養皿的平均值（Xi與Yi）和標準差（σXi與σYi）結果如表1所示。計算15 個重復的標準差（σXi與σYi）的差值（表1），其中2 個重復（編號5、14）的標準差相同，而5 個重復的σXi大于σYi，53%的重復的σXi小于σYi，因此σXi－σYi的值較均勻的分布于0的兩側，說明兩種培養方法計數結果的精密度無明顯差異。

根據1.4節計算敞開式培養與封閉式培養計數結果的復現性相關系數Ri（Ri=｜lgXi－lgYi︱），如表1所示，所有重復的復現性相關系數均小于0.25，滿足標準[27]要求，說明敞開式培養和封閉式培養對于菌懸液中黑曲霉的計數結果無顯著差異。

表1 黑曲霉敞開式培養與封閉式培養比對結果Table 1 Comparison between open culture and closed culture of A. niger

2.4 紫菜中霉菌的重復性

1.3.5 節進行的紫菜（樣品SP14）中霉菌計數，結果如表2所示，其中顯示了1∶100稀釋度的樣品稀釋液的兩個平行培養皿的平均值（Mj、Nj）和標準差（σMj、σNj），并分別計算了9 個重復的標準差的差值（σMjσNj），其中大于0的值有5 個（分別為3、5、6、7、8）、小于0的值為4 個。因此σMj－σNj值較均勻地分布于0的兩側，說明對于紫菜中霉菌的計數，敞開式培養與封閉式培養計數結果的精密度無明顯差異。

計算敞開式培養與封閉式培養的復現性相關系數Rj’（Rj’=｜lgMj－lgNj︱）。表2顯示9 次重復測試中復現性相關系數的最大值為0.220（編號8），均符合標準[27]關于復現性相關系數不大于0.45的要求，因此對于紫菜中霉菌的檢測，敞開式培養和封閉式培養的計數結果無顯著差異。

表2 紫菜中霉菌的敞開式培養與封閉式培養比對結果Table 2 Comparison between open culture and closed culture of mold in laver

2.5 食品中霉菌的比對測試結果

在38 個不同食品樣品（1.3.6節）的霉菌計數結果中，22 個樣品的孟加拉紅平皿無菌落生長，因此不用于后續分析，其余16 個樣品的菌落計數結果如表3所示，其中顯示了不同稀釋度樣品稀釋液的兩個平行培養皿的平均值（Pk、Qk）和標準差（σPk、σQk）。16 個樣品的σPk－σQk的值中，有6 個大于0（分別為SP3、SP4、SP7、SP11、SP33、SP37）、2 個等于0、8 個小于零，較均勻地分布于0的兩側，說明對于食品中霉菌的計數，敞開式培養與封閉式培養計數結果的精密度無明顯差異。

之后計算敞開式培養與封閉式培養的復現性相關系數Rk”（Rk”=｜lgPk－lgQk︱）。16 個樣品中復現性相關系數的最大值為0.138（樣品SP25），因此16 個樣品均符合標準[27]關于復現性相關系數不大于0.45的要求，所以對于食品中霉菌的檢測，敞開式培養和封閉式培養的計數結果無顯著差異。

表3 食品中霉菌的敞開式培養與封閉式培養比對結果Table 3 Comparison between open culture and closed culture of mold in food

2.6 敞開式培養與封閉式培養計數結果標準差的配對t-檢驗

采用1.4節統計分析方法分別對敞開式培養與封閉式培養計數結果的標準差（σXi與σYi、σMj與σNj、σPk與σQk）進行配對t-檢驗，以分析兩種培養方法計數結果精密度差異的顯著性（P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著[29]）。

配對t-檢驗結果如表4所示，其中顯示3 次測試（1.3.4、1.3.5、1.3.6節）的P值分別為0.532、0.894、0.672，均大于0.05，說明封閉式培養與敞開式培養的計數結果精密度差異不顯著，即對于食品中霉菌的檢測，封閉式培養方法與敞開式培養計數結果的精密度不存在統計學意義上的差異。

表4 敞開式培養與封閉式培養標準差的配對t-檢驗結果Table 4 Paired t-test results of standard deviations between open culture and closed culture

2.7 敞開式培養與封閉式培養計數數據的配對t-檢驗

采用1.4節統計分析方法分別對敞開式培養與封閉式培養的培養皿計數結果（Xi與Yi、Mj與Nj、Pk與Qk）進行配對t-檢驗（在配對t-檢驗前需將培養皿計數結果進行對數轉換以使其符合正態分布或近似正態分布[30]），配對t-檢驗結果如表5所示。其中顯示3 次測試的P值分別為0.281、0.105、0.681，均大于0.05，說明封閉式培養與敞開式培養的計數結果的差異不顯著[29]，即對于食品中霉菌的檢測，封閉式培養方法與敞開式培養計數結果不存在統計學意義上的差異。

表5 敞開式培養與封閉式培養計數數據的配對t-檢驗結果Table 5 Paired t-test results of open culture and closed culture

3 討 論

在GB 4789.28—2013《食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》[31]中，黑曲霉（菌株編號：ATCC 16404）被用于孟加拉紅培養基的技術性驗收和質量控制，因此，黑曲霉在孟加拉紅培養基的定量測試數據具有廣泛的代表性，以其為介質的研究結果，在一定程度上可以推廣至食品中霉菌的計數。

通過1.3.2節的測試，獲得了黑曲霉的增殖曲線（圖1），對于黑曲霉的封閉式培養，在空氣與培養基的體積比大于2.8∶1的情況下，當培養至第5天時，黑曲霉的生長不受培養微環境中初始空氣體積的限制。而黑曲霉對氧氣的消耗性實驗（1.3.3節）結果顯示在空氣與培養基體積比為3∶1的條件下，當培養至5 d時，氧氣消耗曲線（圖2）未顯示培養微環境中初始空氣體積能顯著影響封閉式培養過程中黑曲霉的生長。因此將封閉式培養的空氣與培養基的體積比為3∶1，以進行后續的霉菌封閉式培養與敞開式培養的比對測試。

通過3 次測試的標準差分析發現，對于封閉式培養計數結果的標準差大于敞開式培養的比例，1.3.4節中為53%、1.3.5節中為44%、1.3.6節中為50%，說明兩種培養方法的標準差的差異不明顯。而敞開式培養與封閉式培養的標準差配對t-檢驗（2.6節）結果顯示，3 次測試的P值分別為0.532、0.894、0.672（表4），均大于0.05，說明封閉式培養與敞開式培養計數結果的精密度差異不顯著，即對于食品中霉菌的檢測，封閉式培養與敞開式培養計數結果的精密度不存在統計學意義上的差異。

敞開式培養與封閉式培養的復現性相關系數（包括Ri、Rj’、Rk”）計算結果顯示，表1中復現性相關系數的最大值為0.144（編號13），表2中的最大值為0.220（編號8），表3中最大值為0.138（樣品SP25），3 次測試中所有的復現性相關系數均符合標準[27]關于復現性相關系數R不大于0.45的要求。說明對于食品中霉菌的檢測，敞開式培養和封閉式培養的計數結果無顯著差異。2.7節中封閉式培養與敞開式培養計數數據的配對t-檢驗的結果也進一步說明了此問題，表5中3 次測試的P值（分別為0.281、0.105、0.681）均大于0.05，說明封閉式培養與敞開式培養計數結果的差異不顯著，即對于食品中霉菌的檢測，敞開式培養和封閉式培養對同一樣品的計數結果無統計學意義上的差別。

綜上所述，本研究結果顯示：在空氣與培養基體積比為3∶1的條件下，對于霉菌的檢測，封閉式培養方法與標準中明示的敞開式培養方法的計數結果無統計學意義上的差別，二者具有相同的代表性和準確性。據此可以建立以空氣與培養基的體積比不小于3為參數的霉菌的封閉式培養方法，該方法用自封袋將目標培養皿隔離形成霉菌生長的相對獨立的微環境，以防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，從而杜絕霉菌孢子的擴散污染。用建立的封閉式培養方法取代傳統的敞開式培養方法，可以解決霉菌檢測中孢子擴散及污染的難題。因此本研究結果不僅具有較佳的理論價值，還有極其重要的實用價值。該成果還可以廣泛的推廣至各檢測實驗室以及相關企業用于食品品質的監督與評價，也有助于我國霉菌相關檢測標準的完善，以及國家監督水平的提高。