基于有機酸HPLC 指紋圖譜的甜櫻桃果汁摻假鑒定

李佳秀，張春嶺，劉 慧，陳大磊，劉杰超，焦中高*

（中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

甜櫻桃（Prunus avium L.），也稱大櫻桃，為薔薇科李屬植物，其成熟果實色澤艷麗，富含多酚類物質、類胡蘿卜素、褪黑素等生物活性成分，具有抗氧化、抗過敏、保護神經細胞、促進睡眠等功效，可預防癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、神經系統退行性疾病等多種慢性疾病的發生[1]，深受消費者喜愛。但由于甜櫻桃果實肉軟多汁，不耐貯運，嚴重影響了甜櫻桃的市場供應和產業發展[2-3]。將甜櫻桃加工成果汁、果酒、果醬等產品，不僅可滿足人們美好生活和健康飲食的需要，而且延伸了甜櫻桃產業鏈條，有助于減少甜櫻桃采后損失，保障甜櫻桃產業健康發展。其中，甜櫻桃果汁較好保持了果實的色澤、香味和多酚類物質含量及抗氧化活性[4-5]，因此具有較好的市場前景。然而，由于甜櫻桃原料價格較高，供應受限，使得甜櫻桃果汁極易成為摻假的對象，因此迫切需要建立準確度高、適用性廣的甜櫻桃果汁摻假鑒定方法，以維護消費者利益和身體健康以及甜櫻桃果汁行業正常生產秩序，保障甜櫻桃果汁行業健康發展。

當前用于果汁摻假鑒定的方法主要有感官分析法、特征性成分分析法、光譜法、色譜法，以及分子生物學方法等[6-8]。Tezcan等[9]通過比較石榴汁與蘋果汁的氨基酸組成發現L-天冬酰胺可以作為鑒別石榴汁中摻假蘋果汁的特征成分；Nuncio-Jáuregui等[10]通過測定樣品中的脯氨酸、酒石酸、蔗糖含量以及揮發性成分鑒定石榴汁中摻假葡萄汁或桃汁；Wang等[11]采用液相色譜-質譜技術結合主成分分析法，實現了純檸檬汁與摻假檸檬汁（摻入檸檬酸、蔗糖及水）的非靶向識別；Zhang Jiukai等[12]采用液相色譜-四級桿飛行時間質譜技術結合代謝組學分析成功鑒別出藍莓汁和蔓越莓汁中摻假蘋果汁和葡萄汁的行為；Vardin等[13]利用傅里葉轉換紅外光譜結合化學計量學方法對濃縮石榴汁中摻假濃縮葡萄汁的行為進行鑒別；利用紫外光譜結合主成分分析可以清晰地識別蘋果汁中摻假梨汁和甘蔗汁的行為[14]；單核苷酸多態性實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術可用于橙汁中摻假柑橘汁的鑒別[15]。這些方法多基于一些特定的摻假行為或產品，識別方式單一，應用范圍有限，難以適應愈來愈復雜隱蔽的摻假行為。因此，建立簡單易行、適用性廣泛、結果可靠的非靶向果汁鑒偽方法顯得尤為迫切。

指紋圖譜技術是一種從整體上研究復雜物質體系的非靶向化學分析方法，具有整體性和模糊性的特點，能夠較全面地反映復雜物質體系多種化合物及其內在作用關系并顯示特定的化學模式，通過與模式識別技術相結合可有效地提取分析有用信息，因此指紋圖譜技術是對食品等復雜物質體系的整體情況進行研究的一種有效手段。通過建立特征指紋圖譜，可以實現對產品質量和真實性的全面評估。指紋圖譜技術目前主要應用于中草藥及其制劑的質量分析與控制[16]，但近年來隨著技術的發展，指紋圖譜在食品摻假鑒定中也得到了較多的研究和應用[17-19]。喻鳳香等[20]采用氣相色譜法建立了米糠油的脂肪酸指紋圖譜，通過相似度分析可實現摻偽量16%以上的米糠油的定量判斷；胡明華等[21]利用硫酸水解及柱前衍生化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析得到可可粉多糖組分的指紋圖譜，結合系統聚類分析可實現摻加15%及以上可可殼的可可粉的鑒別；Tian Honglei等[22]采用氣相色譜-質譜方法建立了小白杏杏仁油的脂肪酸指紋圖譜，并成功應用于摻假鑒定；孫亞娟等[23]采用頂空固相微萃取和氣相色譜技術建立杏仁油揮發性成分指紋圖譜，可用于菜籽油摻偽量15%以上杏仁油的鑒別；李寶麗等[24]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術建立預包裝純葡萄汁的香氣成分的氣相色譜-質譜指紋圖譜，結合化學計量學分析能準確將預包裝混合果汁、葡萄汁飲料和純葡萄汁鑒別區分；楚剛輝等[25]采用HPLC指紋圖譜結合主成分分析和聚類分析對喀什樹莓果汁與市售其他果汁進行區分。但應用指紋圖譜技術鑒別果汁的摻假還很少見。前期研究發現，不同種類果汁的有機酸組成存在較大差異，可以根據果汁中主要有機酸的組成特征來鑒別果汁類型和控制果汁質量[26]。在此基礎上，本研究采用HPLC法對不同品種的42 個甜櫻桃果汁的有機酸組成進行分析，構建甜櫻桃果汁有機酸的HPLC指紋圖譜，并通過相似度評價、主成分分析和聚類分析，對模擬在甜櫻桃果汁中添加低價果汁（梨汁、蘋果汁、杏汁和桃汁）和外源檸檬酸等摻假方式進行鑒別，以期為甜櫻桃果汁的摻假鑒定和質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜櫻桃果實采自河南新鄭中國農業科學院鄭州果樹研究所大櫻桃示范基地。采收后立即運抵實驗室，剔除病蟲害果、腐爛果，選取大小、著色基本一致的果實供制汁用。共選擇14 個甜櫻桃品種，每個品種在成熟期分3 次采樣。供試甜櫻桃品種及果汁樣品編號見表1。

表1 供試甜櫻桃果汁樣品及編號Table 1 Samples and numbers of sweet cherry juice

草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸標準品 美國Sigma公司；磷酸（分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸氫二銨（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1525型HPLC儀（配有2707自動進樣器、2998二極管陣列檢測器） 美國Waters公司；料理機 九陽股份有限公司；砂芯過濾裝置 津騰實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果汁制備

按照以下工藝制備甜櫻桃果汁：

甜櫻桃果實→去核、梗→打漿→滅酶（沸水浴，5 min）→冷卻→加果膠酶酶解（0.1%，50 ℃，40 min）→冷卻→離心→過濾→甜櫻桃果汁

制得的甜櫻桃果汁貯存于－80 ℃超低溫冰箱，分析前取出2 mL加水定容至10 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 模擬摻假

摻加低價果汁：甜櫻桃果汁中分別摻加體積分數為20%、40%、60%、80%、100%的梨汁、蘋果汁、桃汁和杏汁作為偽品（表2）。

摻加外源酸：在原果汁含量為20%的櫻桃汁中摻加檸檬酸作為偽品，檸檬酸摻加量為果汁總質量的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，共5 個梯度（表2）。

表2 供試摻假樣品及編號Table 2 Numbers of adulterate samples

1.3.3 色譜條件[26]

色譜柱：Ultimate?AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L (NH4)2HPO4溶液（磷酸調pH值為2.4）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：210 nm。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 精密度實驗

取同一甜櫻桃果汁樣品，按1.3.3節色譜條件連續測定5 次，計算各共有峰保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 穩定性實驗

取同一甜櫻桃果汁樣品，按1.3.3節色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h測定，計算各共有峰的保留時間和峰面積的RSD。

1.3.4.3 重復性實驗

取同一甜櫻桃果汁樣品，平行制備5 份供試樣品溶液，按1.3.3節色譜條件分別進樣測定，計算各共有峰保留時間和峰面積的RSD。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel處理實驗數據，將HPLC圖譜數據導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”軟件，構建對照指紋圖譜，并采用夾角余弦法進行相似度評價。用SAS9.3統計分析軟件進行聚類分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜方法學考察結果

采用1.3.3節所述色譜條件，甜櫻桃果汁樣品連續測定5 次，各共有峰保留時間和峰面積的RSD分別小于0.15%和2.38%，說明該方法具有較高的精密度。同一樣品在24 h內的6 次測定結果中，各共有峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.05%～0.99%和0.37%～3.93%，說明該方法在24 h內穩定性良好。同時，重復性實驗結果顯示，各共有峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.03%～0.14%和0.82%～2.82%，表明該方法具有較好的重復性。

2.2 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評價

2.2.1 指紋圖譜共有模式的建立及共有峰的標定

所有甜櫻桃果汁樣品按1.3.3節色譜條件分別進樣分析，得到不同甜櫻桃果汁樣品的HPLC圖譜。將42 個甜櫻桃果汁樣品的HPLC圖譜數據文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”，通過設置參照圖譜、多點校正、色譜峰匹配、生成對照4 個步驟，得到42 個櫻桃汁指紋圖譜的共有模式（即對照指紋圖譜），共標定了10 個共有峰，見圖1。在1.3.3節色譜條件下，將草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸及其混合標準品依次進樣，根據保留時間將標準品溶液的色譜圖與樣品色譜圖進行對比，共指認出了4 個共有峰，其中3號峰為蘋果酸，4號峰為莽草酸，8號峰為檸檬酸，9號峰為富馬酸。

圖1 甜櫻桃果汁HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fi ngerprints of sweet cherry juices

2.2.2 共有峰的相對保留時間和相對峰面積

表3 42 個樣品10 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積Table 3 Relative retention times and relative peak areas of 10 peaks common to 42 samples

續表3

參照峰的確定是建立指紋圖譜的關鍵，通常選取分離度較好、峰位居中、峰面積較大且穩定的色譜峰為參照峰[24,27]。通過比較42 個甜櫻桃果汁的色譜圖，發現3號峰（蘋果酸）分離度好、比較穩定，峰面積也較大，因此選取3號峰作為參照峰，其保留時間和峰面積計為“1”，計算其余共有峰的相對保留時間的平均值和相對峰面積值，結果見表3。可以看出，42 個甜櫻桃果汁樣品的共有峰的相對峰面積差別較大，10 個共有峰的RSD在18.99%～64.97%之間，這說明42 個甜櫻桃果汁的主要特征成分含量差別較大，不同品種、不同時間采摘的櫻桃果汁的指紋圖譜存在一定的差異。

2.2.3 相似度評價與閾值的確定

運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”對42 個櫻桃汁樣品色譜圖和對照指紋圖譜R進行相似度評價，結果見表4。可以看出，所有甜櫻桃果汁的相似度都很高，42 個樣品的指紋圖譜與對照圖譜之間的相似度均在0.948以上。不同品種、不同采摘時間的甜櫻桃，其果汁有機酸HPLC指紋圖譜的相似度差異并不明顯。說明本研究建立的櫻桃汁對照指紋圖譜和標定的10 個共有峰可以反映甜櫻桃果汁的有機酸指紋特征，具有鑒定評價意義。

在指紋圖譜應用于真偽鑒定的評價中，通常采用不同樣品與對照指紋圖譜相似度的平均值或最小值作為閾值[28-29]。在本研究中，42 個不同甜櫻桃果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度均在0.948以上，因此可初步確定0.948為甜櫻桃果汁的相似度閾值，相似度低于0.948則可能是摻假甜櫻桃果汁。

表4 42 個甜櫻桃果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度Table 4 Similarity between fi ngerprints of sweet cherry samples and reference fi ngerprint

2.3 摻假樣品的鑒別

甜櫻桃果汁按1.3.2節摻假方法處理后，按1.3.3節色譜條件進樣分析，得到25 種摻假樣品的色譜圖。應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”軟件將摻假試樣的指紋圖譜與甜櫻桃果汁對照指紋圖譜進行相似度分析，結果見表5。

表5 摻假樣品與甜櫻桃果汁對照指紋圖譜的相似度Table 5 Similarity between fi ngerprints of adulterate samples and reference fi ngerprint

由表5可以看出，隨著低價果汁和檸檬酸摻加量的增加，摻假樣品的指紋圖譜與甜櫻桃果汁對照指紋圖譜的相似度降低。當梨汁與蘋果汁的摻加量達到60%，杏汁的摻加量達到40%時，摻假樣品與對照指紋圖譜的相似度低于甜櫻桃果汁的相似度閾值0.948，此時摻假樣品與甜櫻桃果汁可以區分開。當桃汁摻加量為100%，即完全由桃汁代替甜櫻桃果汁時，才能鑒別出偽品。說明通過相似度評價，用甜櫻桃果汁的HPLC指紋圖譜鑒別摻有桃汁的甜櫻桃果汁偽品的效果較差。由表5還可以看出，當檸檬酸的摻加量不小于0.1%時，摻假果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度即低于甜櫻桃果汁的相似度閾值0.948，從而可以鑒別出來。

2.4 主成分分析

以42 個櫻桃樣品和25 種偽品為研究對象，以每個樣品的指紋圖譜中各色譜峰面積組成原始數據矩陣，用SAS9.3統計分析軟件進行主成分分析，結果見表6和圖2。

表6 主成分的特征值及其貢獻率Table 6 Eigenvalues, proportions and cumulative proportions of principal components

圖2 主成分分析的得分圖Fig. 2 Score plots obtained from PCA

由表6可以看出，根據特征值大于1提取主成分，共提取了3 個主成分，3 個主成分的累計方差貢獻率為73.72%，基本可以反映大部分色譜峰數據所具有的信息。由圖2可見，所有甜櫻桃果汁的得分比較接近，在主成分分析得分圖中聚在一起，添加檸檬酸的所有5 個偽品均遠離甜櫻桃果汁，說明通過主成分分析可以準確地識別摻假檸檬酸的甜櫻桃果汁。摻假梨汁、蘋果汁、杏汁、桃汁的偽品隨著摻加量的增加，在得分圖中的分布也越來越遠，從而實現區分和鑒別。其中，在主成分1和主成分2的得分圖中，摻假杏汁、桃汁的5個偽品均遠離甜櫻桃果汁，表明通過主成分1和主成分2的得分分析可以實現甜櫻桃果汁中摻假杏汁和桃汁的鑒別；而摻加20%梨汁和20%蘋果汁的偽品得分接近甜櫻桃果汁，區分效果不佳。但在主成分1和主成分3的得分圖中，摻假梨汁和蘋果汁的所有偽品都可明顯區分開來，說明通過主成分1和主成分3的得分分析可以實現甜櫻桃果汁中摻假蘋果汁和梨汁的鑒別。二者結合可以實現甜櫻桃果汁與所有摻假樣品的區分。

2.5 聚類分析

圖3 甜櫻桃果汁及摻假樣品的聚類分析樹狀圖Fig. 3 CA dendrograms of sweet cherry juices and adulterate samples

對42 個甜櫻桃果汁樣品和25 種摻假樣品的原始色譜圖提取色譜峰數據，獲得一個矩陣，運用SAS9.3統計分析軟件進行聚類分析，結果見圖3。可以看出，當歐氏距離為0.55時，所有果汁樣品聚為5 類，此時42 個甜櫻桃果汁樣品可以與25 種摻假樣品全部區分開。其中，全部甜櫻桃果汁樣品和摻假檸檬酸的5 種偽品分別單獨聚為一類，摻假杏汁和桃汁的10 種偽品聚為一類，摻加20%蘋果汁的偽品（PW1）單獨為一類，其余9 種偽品聚為一類。

3 討 論

有機酸在果汁中的組成與含量主要與所用水果原料有關，因此可利用其有機酸組成特征來鑒別果汁種類[26]。Navarro-Pascual-Ahuir等[30-31]采用毛細管電泳法分析了不同來源的蘋果汁、菠蘿汁、橙汁、柑橘汁、葡萄汁產品中的有機酸組成及含量，發現蘋果酸是蘋果汁中最主要的有機酸，酒石酸是葡萄汁的特征性有機酸，異檸檬酸在橙汁、柑橘汁和菠蘿汁中普遍存在，利用線性辨別分析方法對所得數據進行化學模式識別，可以實現全部5 種果汁及菠蘿汁摻假50%葡萄汁和橙汁摻假50%葡萄汁的區分和鑒別。研究也表明利用不同種類果汁中有機酸的組成與含量結合化學計量學分析可對果汁種類進行一定的區分[26]。但由于受檢測方法所限，這些研究所涉及的有機酸種類都比較少，所能提供的信息有限。本研究利用果汁中有機酸分析的HPLC法，建立了不同品種的42 個甜櫻桃果汁的有機酸HPLC指紋圖譜，共標定10 個共有峰，數據量較原有的分析結果（4 種有機酸）[26]大幅增加，為進一步進行化學計量學分析提供了更多的信息，有助于獲得更準確的結果。同時，所有甜櫻桃果汁樣品與對照指紋圖譜的相似度均在0.948以上，說明不同品種、不同采摘時間的甜櫻桃所制得的果汁具有很好的一致性，所建指紋圖譜較好反映了甜櫻桃果汁的有機酸組成指紋特征，對于鑒別甜櫻桃果汁具有參考意義。

將指紋圖譜應用于食品質量評價與摻假鑒定必須借助一定的數據統計分析方法才可實現。目前常用的主要有相似度評價、主成分分析、聚類分析、線性辨別分析、偏最小二乘判別分析、多元線性回歸等[19]。劉興勇等[32]采用主成分分析、線性辨別分析和相似度評價3 種方法對瑪咖及其制品HPLC指紋圖譜進行模式識別，發現3種方法均能使瑪咖與瑪咖制品得到較為一致的模式識別結果，通過主成分得分平面圖和辨別分析能夠區分瑪咖和瑪咖制品。Lü Shidong等[33]采用相似度評價、主成分分析和聚類分析3 種方法對12 個云南普洱茶樣品與龍井、竹葉青、六安瓜片、恩施綠茶、碧螺春6 個其他茶樣品的氣相色譜-質譜指紋圖譜進行模式識別，均可得到滿意的區分效果。本研究在模擬摻假甜櫻桃果汁的鑒別中，分別采用相似度評價、主成分分析和聚類分析3 種方法對甜櫻桃果汁樣品和摻假樣品的HPLC指紋圖譜進行模式識別，發現主成分分析和聚類分析均可實現甜櫻桃果汁與摻假樣品的區分，而相似度評價的區分效果較差，僅能識別摻假量較高的樣品。這一方面可能由于本研究摻假的樣品與甜櫻桃果汁成分比較接近，而本研究所采用的相似度評價方法不能有效識別甜櫻桃果汁與摻假樣品指紋圖譜之間的細微差別。另一方面，由于本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”中固定的算法（夾角余弦法）進行相似度評價，而相似度的算法不同，也可對區分效果產生影響[28]，因此在進一步的研究中，也可嘗試不同的相似度計算方法來改善相似度評價法在甜櫻桃果汁摻假鑒別中的應用效果。

此外，為保證果汁的真實性，本研究采用自制甜櫻桃果汁，主要以不同品種和采收時間的甜櫻桃果汁為基礎建立了對照指紋圖譜，初步證實了有機酸HPLC指紋圖譜在甜櫻桃果汁摻假鑒別中的可行性。但果汁中有機酸組成可能還會受到產地、年份以及加工工藝的影響，進一步加大取樣范圍有助于建立更準確、更有效的甜櫻桃果汁指紋圖譜鑒偽方法，從而促進指紋圖譜技術在甜櫻桃果汁鑒偽中的應用。

4 結 論

本研究根據甜櫻桃果汁有機酸的HPLC分析方法，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（V2.0）”軟件，建立了甜櫻桃果汁HPLC指紋圖譜。相似度評價結果表明，42 個甜櫻桃果汁的有機酸指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.948以上，不同品種、不同采收時間的甜櫻桃果汁的指紋圖譜具有很好的一致性。甜櫻桃果汁中添加其他果汁或檸檬酸可導致相似度降低，而且摻假量越大，其指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的差異越大，但摻假量較小的樣品僅用相似度評價不能從甜櫻桃果汁中分辨出來。應用甜櫻桃果汁有機酸的HPLC指紋圖譜結合主成分分析和聚類分析等模式識別方法，可以實現對甜櫻桃果汁和所有摻假低價果汁（梨汁、蘋果汁、杏汁和桃汁）和外源檸檬酸樣品的區分，而且摻假量越大，區分效果越好。因此，有機酸HPLC指紋圖譜結合化學計量學分析，可用于甜櫻桃果汁摻假鑒定和質量控制。