高效液相色譜法測定東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺

郝 宇，孫 波*，張 宇，馬藝熒，解雙瑜，李天一

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機小分子化合物，包括組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、胍丁胺、精胺、亞精胺等，其廣泛存在于生物體及多種食品中，如酒類[1-2]、水產(chǎn)品[3-4]、肉類[5-6]、發(fā)酵食品[7-8]、乳制品[9-10]等。生物胺是生物活性細胞不可缺少組分之一，是機體中生物堿、核苷酸、蛋白質(zhì)和荷爾蒙等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[11]。適量的生物胺對人體有益，但是當人體攝入過量的外源性生物胺時，會引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴重的還會危及生命[12]。

食品中生物胺的存在有3 個必要條件，首先是具有氨基酸脫羧酶活性的微生物的存在，其次是具有合成生物胺的前體物質(zhì)——游離氨基酸的存在，最后是有適合微生物生長繁殖的環(huán)境條件。故在富含蛋白質(zhì)和游離氨基酸的食品或在其制作過程中有微生物參與的發(fā)酵食品中則更容易積累生物胺。發(fā)酵豆制品就是一類極易積累生物胺的食品，在醬油[13]、豆豉[14]、腐乳[15]等發(fā)酵豆制品中的生物胺含量和種類均有研究報道，但在具有地域特色的東北農(nóng)家醬中的生物胺種類和含量鮮見報道。東北農(nóng)家醬是我國北方特有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其以大豆為原料，依靠環(huán)境中的米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物[16]自然發(fā)酵而成。其生產(chǎn)環(huán)境開放，微生物區(qū)系復(fù)雜，這一特點使得東北農(nóng)家醬中存在生物胺含量積累的可能性，故檢測東北農(nóng)家醬中生物胺的種類和含量變得尤為重要。

目前，食品中生物胺的檢測和分析方法主要包括毛細管電泳法[17]、生物傳感器法[18]、薄層色譜法[19]、氣相色譜法[20]、離子色譜法[21]和反相高效液相色譜法[22]，其中高效液相色譜法是定量分析生物胺的主要檢測方法，具有檢測靈敏度高、線性關(guān)系良好、分析定量準確等優(yōu)點，是目前較理想的檢測方法。而東北農(nóng)家醬因其成分復(fù)雜，含有較多的蛋白質(zhì)和油脂，使其前處理和定量檢測受到了一定限制。因此，本實驗對東北農(nóng)家醬中生物胺處理條件：提取劑的選擇、衍生劑用量的使用和衍生物萃取劑的選擇進行研究，從而建立一種適合測定東北農(nóng)家醬生物胺含量的高效液相色譜法，并使用建立的方法測定市售東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺，該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，準確度和靈敏度高，可為東北農(nóng)家醬的質(zhì)量安全控制提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北農(nóng)家醬 市售。

標準品：組胺鹽酸鹽（CAS號：56-92-8，98%）、酪胺鹽酸鹽（CAS號：60-19-5，98%）、腐胺鹽酸鹽（CAS號：333-94-7，98%）、亞精胺（CAS號：124-20-9，97%）、β-苯乙胺（CAS號：64-04-0，98%） 上海士鋒生物科技有限公司；丹磺酰氯（CAS號：605-65-2，99%） 美國Sigma公司；甲醇、丙酮（均為色譜純）；三氯乙酸、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、鹽酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配2487紫外檢測器、Empower工作站） 美國Waters公司；LG10-2.4A高速離心機北京醫(yī)用離心機廠；ZGDCY-24孔水浴氮吹儀 上海梓桂儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004分析天平 上海衡平儀器儀表廠；SZ-1型快速混勻器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽、亞精胺、β-苯乙胺分別稱取16.91、12.89、18.67、10.31、10.20 mg，用0.1 mol/L HCl溶液配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的生物胺標準儲備溶液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩７謩e取上述溶液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，充分混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的生物胺標準混合使用液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

準確稱取東北農(nóng)家醬10.0 g，加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，混勻，振蕩提取30 min，6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL容量瓶中，殘渣用10 mL 5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀釋至刻度，待凈化。移取上述試樣提取液5 mL于25 mL具塞試管中，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入5 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，靜置分層后棄去上層有機相，下層試樣溶液加入5 mL正己烷再除脂一次，過濾，待衍生。

1.3.3 樣品衍生化

在1.3.2節(jié)待衍生的試樣溶液中依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、0.8 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為丙酮），渦旋混勻1 min后置于60 ℃恒溫水浴中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應(yīng)15 min。取出，冷卻至室溫，于每個離心管中加入1 mL水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入3 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出上層有機相，再萃取一次，合并乙酸乙酯萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL甲醇渦旋振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾于進樣小瓶，待測定。

1.3.4 標準曲線的建立

分別取生物胺標準混合使用液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的生物胺標準系列溶液。分別移取1 mL生物胺標準系列溶液，操作同樣品的衍生步驟并進行檢測，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，計算平均值。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：254 mm；流動相A：甲醇，流動相B：超純水；采用梯度洗脫，經(jīng)實驗調(diào)整，最終確定本研究最佳洗脫程序見表1。流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0、SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。每組平行3 次，測定結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

表2 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中不同添加量的5 種生物胺的RSD（n=3）Table 2 RSDs for 5 biogenic amines at 5.0, 10.0 and 15.0 mg/L (n= 3)

東北農(nóng)家醬中含有蛋白質(zhì)、脂肪、游離氨基酸及其他復(fù)雜成分，這些成分的存在影響生物胺的有效分離和準確定量。故合適的前處理方法，可以降低雜質(zhì)含量，降低干擾，得到較高的回收率，提高靈敏度。常見的提取劑有酸性介質(zhì)和有機介質(zhì)。對于肉類、水產(chǎn)品及植物性食品中生物胺的提取一般以鹽酸[23]、高氯酸[24]、三氯乙酸[25]等酸性介質(zhì)提取，但5%三氯乙酸在這類樣品中沉淀蛋白效果好于鹽酸；而在奶酪中鹽酸對生物胺的提取效果較好[26]。提取劑種類的選擇與所分析的樣品基質(zhì)特性有關(guān)，故本研究選取0.1 mol/L鹽酸、5%三氯乙酸和無水乙醇進行對比，在5.0、10.0、15.0 mg/L三種不同添加水平下對東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺進行提取，實驗結(jié)果見表2、圖1～3。

圖1 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量5.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n= 3）Fig. 1 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 5.0 mg/L (n = 3)

當5 種生物胺添加量為5.0 mg/L時，三氯乙酸對5 種生物胺的提取回收率為85.7%～102.3%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不高于6.1%；鹽酸對5 種生物胺的提取回收率為79.1%～99.2%，RSD不高于8.2%；無水乙醇對5 種生物胺的提取回收率為60.5%～98.4%，RSD不高于10.3%。其中三氯乙酸對β-苯乙胺、酪胺、亞精胺的回收率均高于鹽酸和無水乙醇對這3 種生物胺的回收率，差異性顯著（P＜0.05），無水乙醇對腐胺的提取回收率高于三氯乙酸和鹽酸，但是其對組胺的回收率為60.5%，遠低于另外兩種提取劑。

圖2 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量10.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n=3）Fig. 2 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 10.0 mg/L(n = 3)

當5 種生物胺添加量為10.0 mg/L時，三氯乙酸對5 種生物胺的提取回收率為84.2%～101.6%，RSD不大于6.0%；鹽酸對5 種生物胺的提取回收率為60.7%～95.0%，RSD不大于9.3%；無水乙醇對5 種生物胺的提取回收率為50.2%～78.9%，RSD不大于16.9%。三氯乙酸對5 種生物胺的提取回收率均高于鹽酸和無水乙醇，差異性顯著（P＜0.05），且RSD均低于另外兩種提取劑，回收率及精密度均符合檢測要求，而無水乙醇提取5 種生物胺的RSD高于10%，并不符合檢測要求。

圖3 3 種溶劑提取東北農(nóng)家醬中添加量15.0 mg/L的5 種生物胺的添加回收率（n= 3）Fig. 3 Recoveries of 5 biogenic amines from spiked sample at 15.0 mg/L (n = 3)

當5 種生物胺添加量為15.0 mg/L時，三氯乙酸對5 種生物胺的提取回收率為80.7%～96.2%，RSD不大于5.5%；鹽酸對5 種生物胺的提取回收率為65.1%～90.2%，RSD不大于8.4%；無水乙醇對5 種生物胺的提取回收率為52.7%～70.4%，RSD不大于20.4%。三氯乙酸對5 種生物胺的提取回收率均高于鹽酸和無水乙醇，差異性顯著（P＜0.05），且RSD均低于另外兩種提取劑，回收率及精密度均符合檢測要求，而鹽酸對生物胺的提取回收率相對于三氯乙酸較低，不符合檢測要求，無水乙醇RSD高于10%，沒有良好的重復(fù)性，同樣不符合檢測要求。

綜上，在5.0、10.0、15.0 mg/L的添加水平下，三氯乙酸對5 種生物胺提取回收率分別為85.7%～102.3%、84.2%～101.6%和80.7%～96.2%，RSD分別不大于6.1%、6.0%和5.5%。回收率和精密度均符合檢測要求，可以說明三氯乙酸是一種提取東北農(nóng)家醬中生物胺的理想溶劑。且三氯乙酸對東北農(nóng)家醬的處理時間只需30 min，從整體提取效果來看，三氯乙酸提取具有操作簡單快速、回收率相對較高的優(yōu)點，是分析東北農(nóng)家醬中生物胺的一種較為理想的提取溶劑。

2.2 衍生劑的選擇及用量

生物胺自身沒有熒光或紫外發(fā)光基團，且其屬于極性分子，需經(jīng)過對其進行衍生來提高其在柱子中的溶解性，使其極性得到降低，才能對其含量進行準確測定。生物胺衍生劑有苯甲酰氯、丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、熒光胺、N-羥基丁二酰亞胺酯類化合物等，目前最常使用的衍生劑是丹磺酰氯和鄰苯二甲醛。但鄰苯二甲醛和生物胺反應(yīng)后需立即測定，存在反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定的缺點，而丹磺酰氯與單胺和二胺均可反應(yīng)，且反應(yīng)后產(chǎn)物穩(wěn)定，有較強的紫外吸收等優(yōu)點。董偉峰等[27]將丹磺酰氯和生物胺反應(yīng)后的衍生物放置－20 ℃避光環(huán)境6 個月后發(fā)現(xiàn)其成分無太大變化。故選擇丹磺酰氯作為衍生劑，并對其最適衍生用量進行研究，分別添加2、4、6、8、10 mg/mL丹磺酰氯的丙酮溶液與質(zhì)量濃度為50 mg/L的生物胺混標溶液進行反應(yīng)，結(jié)果見圖4。

圖4 丹磺酰氯添加量對生物胺衍生物生成量的影響Fig. 4 Effects of addition level of sulfonyl chloride on the production of biogenic amine derivatives

由圖4可以看出，隨著丹磺酰氯添加量的增加，5 種生物胺衍生物也在不斷增加，當?shù)せ酋Ｂ忍砑恿繛?.8 mL時，衍生物峰面積達到最大，且隨著衍生劑用量的增加，衍生物的量并未明顯增加，當衍生劑用量為1.0 mL時，組胺衍生物達最大量，但與丹磺酰氯添加量為0.8 mL時并無顯著差異（P＞0.05），考慮到衍生劑過量會對生物胺色譜圖產(chǎn)生干擾，故選擇0.8 mL作為衍生劑的最適用量。

2.3 衍生物萃取劑的選擇

本研究使用丹磺酰氯進行樣品衍生化處理，過程中加入堿性緩沖溶液，使衍生物溶液中含有無機鹽；而東北農(nóng)家醬基質(zhì)復(fù)雜，并且衍生后生物胺衍生物存在渾濁現(xiàn)象，為避免檢測中色譜柱受到雜質(zhì)損害并保證檢測的準確性，經(jīng)查閱文獻，本研究選擇三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚作為衍生物萃取劑對東北農(nóng)家醬樣品中的生物胺進行進一步的富集純化，結(jié)果見圖5。衍生物萃取結(jié)果表明，這3 種溶劑均可將生物胺衍生物萃取出來，但經(jīng)三氯甲烷和乙醚萃取的生物胺衍生物，峰形均不正常且存在峰沒有完全分離的現(xiàn)象，這可能是由于東北農(nóng)家醬樣品經(jīng)衍生后還產(chǎn)生其他一些物質(zhì)，乙酸乙酯只能將生物胺衍生物萃取出來，而乙醚和三氯甲烷可能將生物胺衍生物和其他物質(zhì)一同萃取出來[28]。并且使用氮氣吹干萃取劑時，三氯乙酸的揮發(fā)速度明顯低于另外兩種萃取劑；而又因為乙醚毒性高于乙酸乙酯，綜合考慮，選擇乙酸乙酯作為本研究的生物胺衍生物萃取劑。

圖5 乙酸乙酯（A）、乙醚（B）、三氯甲烷（C）萃取生物胺衍生物的圖譜Fig. 5 HPLC chromatograms of ethyl acetate (A), ether (B), and chloroform (C) extracts of biogenic amine derivatives

2.4 標準曲線和線性關(guān)系

圖6 生物胺標準品（A）和東北農(nóng)家醬（B）中生物胺色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of biogenic amine standards (A) and biogenic amines from soybean paste (B)

由圖6A可知，5 種生物胺在40 min內(nèi)可以完全分離，且峰形對稱。東北農(nóng)家醬樣品中生物胺色譜圖見圖6B。以生物胺標準系列溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得出線性范圍；將加標樣品逐漸稀釋，衍生后進樣，以3 倍信噪比作為檢出限，結(jié)果見表3。

表3 生物胺的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations for biogenic amines

由表3可知，5 種生物胺在1～50 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2不小于0.99，峰面積和生物胺含量之間具有顯著線性相關(guān)。檢出限在0.02～0.06 mg/kg之間，該方法靈敏度高，可以滿足生物胺測定的要求。

2.5 重復(fù)性、精密度及加標回收實驗結(jié)果

選取同一東北農(nóng)家醬樣品經(jīng)衍生后連續(xù)進行重復(fù)測定5 次，RSD低于5%，表明該方法重復(fù)性良好，精密度良好，達到分析要求，結(jié)果見表4。

表4 方法的精密度實驗（n=5）Table 4 Results of precision tests (n= 5)

=3）Table 5 Recoveries of biogenic amines from spiked sample (n= 3)表5 生物胺加標回收率的測定（n

選取東北同一農(nóng)家醬樣品，在線性范圍內(nèi)選取5.0、10.0、15.0 mg/L三個質(zhì)量濃度添加標準品溶液，經(jīng)衍生后進行測定，每個樣品進行3 次平行測定，得平均加標回收率在82.23%～104.87%之間，RSD在1.56%～4.28%（n=3）之間，符合檢測要求，結(jié)果見表5。

2.6 樣品測定結(jié)果

表6 市售東北農(nóng)家醬中生物胺含量Table 6 Contents of 5 biogenic amines in farmhouse soybean paste samples from northeastern China mg/kg

由表6可知，不同東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺含量不盡相同，這可能是由于不同東北農(nóng)家醬的發(fā)酵環(huán)境不同導(dǎo)致的。總體來說，組胺、腐胺、亞精胺和β-苯乙胺在6 種樣品中均檢測到，其中1 種樣品中未檢測到酪胺。6 種樣品生物胺總含量范圍為25.41～444.93 mg/kg，其中對人體危害較大的組胺和酪胺含量分別在1.67～68.98 mg/kg和0～5 0.3 2 m g/k g之間，腐胺含量范圍為4.98～103.82 mg/kg，亞精胺含量范圍為7.80～102.21 mg/kg，β-苯乙胺含量范圍為5.27～150.62 mg/kg。

在東北農(nóng)家醬發(fā)酵過程中，大量的環(huán)境微生物進入其中。其發(fā)酵過程具有不確定性和隨意性，且自然發(fā)酵周期長，微生物發(fā)揮較大作用。這些微生物既有有益微生物，又有有害微生物，都存在產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的可能性，如若有害微生物含量存在過多，產(chǎn)胺微生物對其中氨基酸利用的比較徹底，導(dǎo)致東北農(nóng)家醬中生物胺含量的增高。歐洲食品安全管理局證實組胺和酪胺毒性最大，特別與食品安全有關(guān)[29]。斯洛伐克共和國營養(yǎng)法典[30]確定了以下兩種生物胺的最大耐受限量：組胺（啤酒為20 mg/kg，魚和魚制品為200 mg/kg）和酪胺（200 mg/kg）。且荷蘭乳制品研究所和捷克建議肉制品中組胺的推薦上限為100～200 mg/kg。由此可知，東北農(nóng)家醬中的生物胺對人體存在潛在的安全問題，監(jiān)測東北農(nóng)家醬中生物胺含量及微生物的存在情況和以生物胺為檢測指標建立東北農(nóng)家醬的安全評價體系勢在必行。

3 結(jié) 論

本研究建立的高效液相色譜法適用于東北農(nóng)家醬中5 種生物胺的測定。該方法線性范圍較廣、重復(fù)性好、準確性高，能快速簡便地對東北農(nóng)家醬中的生物胺進行檢測分析。使用本研究建立的高效液相色譜法測定不同市售東北農(nóng)家醬中的5 種生物胺，其含量存在較大差異，故在東北農(nóng)家醬生產(chǎn)中應(yīng)注意控制其發(fā)酵環(huán)境，減少微生物的污染，從而進一步控制東北農(nóng)家醬發(fā)酵過程中存在的生物胺。且東北農(nóng)家醬發(fā)酵過程中生物胺的形成機制和變化規(guī)律尚不明確，有待日后進一步深入研究。