鈣鹽和蛋白質配比對1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油酯乳液體外消化的影響

伍文彬，徐雨茜，熊 華，胡蔣寧，朱雪梅,,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.大連工業大學 國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

母乳是嬰兒最理想的優質食物，因為它使必需營養素和特定生物活性成分如生長因子、免疫因子和特異性酶等達到符合嬰兒健康生長的黃金標準[1]。在嬰兒生長發育過程中，母乳組分及其消化產物在改善消化成熟度、調節微生物群發育和免疫系統中有重要作用[2-4]，研究表明，母乳脂肪主要成分1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油酯（1,3-dioleyl-2-palmitoylglycerol，OPO）在嬰兒早期食物消化吸收中起到關鍵作用，這與嬰兒自身的消化吸收特點密切相關。脂肪的有效消化及利用對嬰兒生長和發育至關重要，母乳形成的特定乳液形式可以對特定的營養物質進行高效地包裹、保護和定向運輸，使其在胃腸道消化過程達到指定的位置，發揮最大的效果。人乳中的主要成分是乳清蛋白和酪蛋白，而且乳清蛋白和酪蛋白的比例隨著泌乳期的不同而有較大的變化，人初乳中的乳清蛋白與酪蛋白的比例是90∶10，常乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例是60∶40，到泌乳后期，人乳清蛋白與酪蛋白的比例是20∶80[5]，嬰兒奶粉蛋白組成基于此特點而設計，并根據不同的需求加以改進。乳清蛋白與酪蛋白具有較好乳化性，利用乳清蛋白和酪蛋白作為乳化劑與OPO型結構脂形成穩定的乳液可以更好地在成分與結構上模擬母乳。已知營養物質的正常消化是保障新生嬰兒健康生長和發育的基本功能。因此，從消化原理上對OPO型乳液的消化過程進行相應的解剖和探索，根據消化特性指導功能性食品的開發以及對疾病的科學預防，對嬰兒健康成長有著重要的意義。

在人體內，脂肪消化是一個錯綜復雜的過程。目前，關于脂肪消化的研究主要有體內和體外兩大類。諸多學者對影響脂肪消化的因素如膽鹽、脂肪酶、乳化劑、礦物離子（Ca、K、Mg）等進行了相應的研究。Armand等[6]通過考察鈣離子、脂滴大小、甘油三酯組成對消化后的生物利用率進行了初步研究，但未對機理進行相關探索和闡述。Nguyen等[7]在不含酶的情況下，以凝膠電泳、激光共聚焦、pH-stat等手段，探究酪蛋白、乳清蛋白及大豆蛋白不同乳化劑對模擬嬰兒胃腸道體外消化的影響，闡明了不同乳化劑在嬰兒胃腸道的基本消化情況。Hu Min等[8]以玉米油為原料、鈣離子和鈣結合劑為影響因素，考察了脂類在消化過程中，隨著鈣的增加，脂肪的消化速率以及用于穩定初始脂滴的溶血卵磷脂、酪蛋白酸鹽和β-乳球蛋白等不同乳化劑消化速率的能力變化。Sarkar等[9]用體外法定量研究膽鹽在乳化脂質消化動力學過程中的作用，解釋了由酪蛋白鈉和膽鹽穩定乳液的消化行為，為食品配方的脂肪消化提供了新的見解。但是以OPO型結構脂作為研究對象，探究蛋白質、鈣鹽濃度和鈣鹽種類對OPO型結構脂乳液消化影響的報道較少。

本實驗以OPO結構脂為油料制備乳化液，考察不同乳清蛋白和酪蛋白配比、鈣鹽濃度及鈣鹽種類等因素，對消化后粒徑大小、粒徑分布、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）的釋放速率和程度及甘油酯組成方面進行體外消化行為研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OPO型母乳替代酯油脂由實驗室自制；乳清蛋白（純度91%～92%） 愛爾蘭Glanbia公司；牛奶酪蛋白（純度99%） 陜西泰克生物科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鈣、碳酸鈣、疊氮化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZDJ-4A雷磁自動電位滴定儀 上海書培實驗設備有限公司；7890B氣相色譜儀 美國安捷倫公司；Ms3000-LV-AeroS激光衍射粒度分析儀 英國馬爾文公司；SRH高壓均質機 上海申鹿均質機有限公司；Ultra Turrax T18高速分散機 德國IKA公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁新徑儀器有限公司；LXJ-IIB型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 OPO結構脂的制備

分別稱取底物三棕櫚酸甘油酯和茶油FFA以1∶5的物質的量比于具塞三角瓶中，加3 mL/g（總底物）丙酮，50 ℃、200 r/min ZH-S全溫振蕩器充分振蕩混合20 min。待底物溶解充分后，加入10%總底物質量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM于aw為0.53反應6 h，離心除酶，最后得到反應產物OPO甘油酯。

1.3.2 水包油型乳液的制備[10]

分別稱取一定質量配比乳清蛋白和酪蛋白混合物置于燒杯中，室溫條件加入10 mmol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制成質量濃度為1 g/100mL的蛋白質溶液，磁力攪拌5 h，直至溶解完全，水化過夜。待水化完成后，取出恢復至常溫，加入溶解充分的10% OPO油脂混合均勻，在12 000 r/min條件下進行高速分散2 min，隨后在30 MPa條件下高壓均質2 min，循環3 次，得到新鮮乳液。為抑制微生物的破壞，可加入0.02 g/100 mL的疊氮化鈉于新鮮乳液中，最后置于4 ℃冰箱中備用即可。

1.3.3 OPO型乳液體外模擬消化

相較于成人，嬰幼兒的胃腸道消化環境與之有較大區別。因此，在根據Nguyen[7]和De Oliveira[11]等對胃腸道消化特點的描述，稍作修改進行體外消化模擬。

1.3.3.1 胃模擬液的消化

用0.1 mol/L HCl溶液將含有0.2 g NaCl溶液pH值調至5.5，配制成胃液。待胃液配制完全，加入1.3 mg/mL胃脂肪酶和1.5 mg/mL胃蛋白酶，在37 ℃磁力攪拌15 min，備用。取一定乳液于燒杯中，分別加入不同濃度（0、5、10、20 mmol/L）的CaCl2和20 mmol/L的不同鈣鹽（乳酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣），在37 ℃預熱攪拌15 min，使其充分溶解。最后將預處理的乳液與胃液以2∶1的體積比分別取出，用0.1 mol/L HCl溶液調pH 5.5，未消化的樣品為G0，混合進行胃消化30 min，記為G30。在模擬胃消化過程中，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，保持體系pH值始終維持5.5，記錄不同時間NaOH消耗的量。為減少誤差，每個樣品測量3 次，取3 次重復測量平均值。

1.3.3.2 腸模擬液的消化

用0.1 mol/L HCl溶液將含有150 mmol/L NaCl、39 mmol/L K2HPO4的溶液pH值調至6.5，配制成腸液。待腸液配制完全，加入1.875 mg/mL膽鹽，0.6 mg/mL胰酶，在37 ℃磁力攪拌15 min，備用。將上述消化30 min的模擬胃液作為起始原料，用0.5 mol/L NaOH溶液調pH 6.5，與預處理腸液按體積比1∶1進行混合消化120 min。在此期間，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，始終保持體系pH值維持6.5，記錄不同時間NaOH消耗的量。在開始腸消化0（G30）、30（I30）、60（I60）、90（I90）、120 min（I120）收集消化樣品，于80 ℃進行滅酶5 min，停止反應。為減少誤差，每個樣品測量3 次，取3 次重復測量平均值。

1.3.4 乳液粒徑的測定[12]

采用激光衍射粒度分析儀檢測原乳液和胃腸消化乳液的粒徑大小和分布。對于分散相，乳液的折射率為1.59；連續相，水的折射率為1.33。將乳液逐滴分散至裝有去離子水的測量池中進行超聲攪拌，至遮蔽率達到15%。測量粒度值用d（0.1）、d（0.5）、d（0.9）和D[4,3]表示。前3 個值表示存在于顆粒總數的10%、50%和90%以下的顆粒群的大小。D[4,3]為大顆粒體積平均值的表征。為減少誤差，每個樣品測量3 次，取3 次重復測量平均值。

1.3.5 OPO母乳替代脂消化率的測定

脂肪的消化率由脂肪酸的釋放率表示。乳液在消化過程中釋放FFA的百分比由中和FFA所需的NaOH物質的量除以可由三酰甘油產生FFA物質的量計算（假定每1 個甘油三酯分子產生2 FFA）。釋放率計算公式如下：

式中：C為滴定消化液NaOH的濃度/（mol/L）；V為中和乳液消化釋放FFA所需NaOH的體積/mL；M為OPO油脂的平均摩爾質量/（g/mol）；m為消化乳液中加入的油脂量/g。

1.3.6 消化產物脂肪酸分析

根據Bligh等[13]提取脂肪的方法，用氯仿-甲醇溶液對模擬胃腸道消化液進行脂肪的萃取。將萃取的混合液振蕩均勻，靜置分層（有機層和水層），取有機層旋蒸除去溶劑，得到提取物FFA、甘油一酯（monoacylglycerol，MAG）、甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和甘油三酯（triacylglycerol，TAG）。利用薄層色譜對脂肪進行水解產物的分離，刮取所需FFA和MAG條帶，甲酯化，然后對消化產物FFA和MAG進行氣相色譜分析。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 CaCl2對乳液脂質消化的影響

2.1.1 體外模擬脂質消化動力學分析

本實驗主要從胃腸道消化系統，較為全面地研究腸內組分（鈣）和外在因素（乳化劑）對OPO型乳液脂質體外模擬消化的影響。從圖1a～c可知，在相同乳化劑配比、不同CaCl2濃度的情況下，隨著CaCl2濃度的增加，OPO型乳液脂質的生物利用率提高。在胃消化初始階段，0∶10乳化劑配比的脂質消化速率大于10∶0和6∶4，隨著消化的進行，在低于20 mmol/L CaCl2的濃度下，3 組不同乳化劑配比乳液均在5 min左右，FFA釋放率達到飽和，除10∶0乳液（10 mmol/L CaCl2）在10 min時，FFA釋放率驟然增加。產生這種現象的原因可能是由酪蛋白在胃中的消化機理造成的。酪蛋白在胃酸的作用下，易形成凝塊，影響脂質的消化[14]。圖1d顯示，在20 mmol/L CaCl2濃度下，隨著乳清蛋白-酪蛋白配比的減少，0∶10乳液FFA釋放率最低，6∶4乳液次之，10∶0乳液FFA釋放率最高，但與6∶4乳液FFA釋放率大體一致，相差甚少。此研究結果與Thompkinson等[15]報道相符合。

圖1 乳化劑配比對OPO型乳液體外模擬胃消化過程FFA釋放率的影響Fig. 1 Effect of emulsifier ratio on FFA release rate from OPO emulsions in the presence of 20 mmol/L CaCl2 during in vitro simulated gastric digestion

圖2 不同CaCl2濃度下不同乳化劑配比乳化乳液體外模擬腸消化過程的FFA釋放率Fig. 2 Release rate of total free fatty acids from emulsions stabilized with different whey protein-casein mixtures at different CaCl2 concentrations during in vitro simulated intestinal digestion

由圖2可知，3 組不同乳化劑配比乳液，消化前期消化速率依次為10∶0＜6∶4＜0∶10。在較長的消化時間下，無論是否含有鈣，3 組乳液中FFA釋放的速率都大體相似，趨于平緩。在濃度為20 mmol/L CaCl2的作用下，3 組乳液最終消化程度依次為10∶0（55.69%）＞6∶4（47.82%）＞0∶10（45.12%），消化程度變化不大，可能與鈣對乳液特性的影響有關，因為鈣是通過絮凝影響乳液穩定性[16-17]。總之，在整個腸消化過程中，3 組不同乳化劑配比乳液在不同CaCl2濃度下，FFA液體外模擬腸消化過程的FFA釋放速率及程度均隨CaCl2濃度的增加而增加，說明鈣對脂質的消化有促進作用[18]。產生這種現象的主要機理是：在腸消化過程中，脂質在脂肪酶的進攻下，水解成MAG、DAG和FFA。隨著消化程度增加，水解產物FFA于油-水界面不斷積聚阻礙脂肪酶進攻脂滴，減少吸附位點，抑制脂肪酶活性，從而降低脂質消化率。而鈣離子可以與水解 產物FFA形成脂肪酸鈣皂，通過增加低熔點脂肪酸的極性促進其溶解，或與高熔點脂肪酸生成不溶性的脂肪酸 鈣皂沉淀，將FFA從脂滴表面移除，為脂質的進一步消化提供包被點[19-20]。因此添加鈣離子等營養素可以在一定程度上促進脂肪的消化。

2.1.2 體外模擬脂質消化產物脂肪酸組成分析

表1 乳清蛋白-酪蛋白配比6∶4乳液體外模擬胃腸消化后FFA和MAG脂肪酸組成Table 1 Free fatty acid and monoglyceride composition of emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsifier during in vitro simulated gastrointestinal digestion

體外模擬脂質消化過程中，由于乳液特殊的運輸體系和包裝功能，引起學者對脂質消化速率及營養利用率產生極大興趣。作為營養成分OPO型油脂的直接載體，FA組成分析是最為關鍵的評價指標。已有研究證明脂質的FA組成及結構差異對其乳液消化有一定影響[21]。從表1可知，6∶4乳液在胃腸消化后，隨著CaCl2濃度的遞增，無論是FFA還是MAG脂肪酸組成，C16:0和C18:1c9含量最高，與OPO型油脂FA成分一致[22]。在0～20 mmol/L CaCl2濃度范圍內（除10 mmol/L CaCl2），對于消化水解產物FFA和MAG，C16:0和C18:1c9相對含量分別為C16:0（31.29%～37.14%）＜C18:1c9（49.58%～55.78%），C16∶0（61.63%～71.19%）＞C18:1c9（20.96%～30.38%）。產生這種結果主要歸因于OPO型油脂的FA結構。在母乳脂肪中，飽和FA（C16:0、C18:0）主要酯化在Sn-2位，而不飽和FA（C18:1c9、C18:2c9c12）主要酯化在Sn-1,3位，這種結構有利于嬰幼兒更好地消化吸收，減少能量的損耗和礦物質的流失[23]。如圖3所示，對于消化水解產物FFA而言，在不含CaCl2、腸消化（I30～I120）過程中，不飽和FA（C18:1c9、C18:2c9c12）隨消化時間的延長，FA含量緩慢增加，飽和FA（C14:0、C16:0、C18:0）則與之相反。對于含有20 mmol/L CaCl2、腸消化（I30～I120）過程中，飽和與不飽和FA的變化趨勢均不明顯，可能是因為在腸消化過程中，Ca2＋與水解產物飽和FA反應，生成難溶性沉淀物，不利于脂質生物利用[10]。其次，含有CaCl2和不含CaCl2的水解產物FFA和MAG，其FA組成是沒有區別的，且C16:0和C18:1c9的百分比大小與表1相類似。

圖3 乳清蛋白-酪蛋白（6∶4）乳液體外模擬胃腸消化過程脂肪酸組成Fig. 3 Free fatty acid and monoglyceride composition of emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsifier during in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.1.3 體外模擬脂質消化平均粒徑分析

圖4 乳清蛋白-酪蛋白（6∶4）乳液在不同鈣鹽體外模擬胃腸消化前后過程的粒徑分布Fig. 4 Particle size distribution of emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsifier during in vitro simulated gastrointestinal digestion

脂質在消化過程中，脂滴的粒徑大小及分布是評價乳液穩定性的重要標尺。脂滴大小決定脂肪酶吸附位點數目即與脂滴表面積的接觸程度，影響嬰兒配方食品體外消化過程中的流變行為[24]。因此，研究脂滴的粒徑大小及分布對嬰幼兒配方奶粉的設計有一定的指導作用。由圖4可以看出，在不同CaCl2濃度下，新鮮乳液的平均粒徑均小于胃腸消化后的乳液，尤其是未加CaCl2的乳液平均粒徑范圍僅在0.1～1 μm，胃腸消化后平均粒徑范圍均在10～1 000 μm，表明Ca2＋與脂質水解產物FFA反應，形成大顆粒物質[18]。在胃腸消化過程中，各乳液呈現出雙峰現象，隨著Ca2＋濃度的增加，雙峰現象趨于明顯。

表2數據表明，隨Ca2＋濃度的增加，新鮮乳液的d（0.1）、d（0.5）、d（0.9）值均增加，在加入胃腸消化液后，平均粒徑顯著增大。研究顯示，未加CaCl2乳液樣品d（0.9）從0.62 μm（G0）急劇上升到507 μm（G30），而后緩慢下降至453 μm（I120），這主要是因為開始加入胃腸消化液后，消化酶水解脂質產生FFA，與界面層蛋白發生競爭，可能通過“造山運動”破壞蛋白結構，脂滴聚集造成粒徑增大，隨后聚集脂滴在消化酶的作用下分解，出現小、中等顆粒，促使粒徑變小[25-26]。對于加入CaCl2乳液的樣品，d（0.9）均從G0上升而后緩慢下降，但上升速度均遠小于未加CaCl2乳液樣品，證明Ca2＋在未消化時，通過靜電屏蔽作用與陰離子蛋白發生絡合，使得脂滴聚集[27]。

表2 不同CaCl2濃度下乳清蛋白-酪蛋白（6∶4）乳液體外模擬胃腸消化前后的粒度分布Table 2 Particle size distribution of emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsi fi er during in vitro simulated gastrointestinal digestion

圖5 不同CaCl2濃度下乳清蛋白-酪蛋白（6∶4）乳液體外模擬胃腸消化前后的體積平均D[4,3]分布Fig. 5 Volume mean diameter D[4,3] of emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsi fi er during in vitro simulated gastrointestinal digestion

如圖5所示，在6∶4乳液樣品中，初始粒徑隨Ca2＋濃度的增加而增加，D[4,3]分別為0.45、13.7、171、277 μm。在胃消化階段（0～30 min），不同濃度的CaCl2乳液平均粒徑急劇上升，其0、5 mmol/L CaCl2乳液的上升速率最快，20 mmol/L CaCl2乳液最慢。隨著消化時間的進一步增加，乳液平均粒徑緩慢下降，幾乎保持恒定。這與Ye Aiqian等[28]觀察的結果類似。

2.2 不同鈣鹽對乳液脂質消化的影響

據GB 14880—2012《食品營養強化劑使用標準》，鈣營養強化劑有可溶性鈣和難溶性鈣之分[29]。目前國內使用的鈣營養強化劑主要是碳酸鈣，國外則是磷酸鈣。由于種種原因，外源性鈣易缺乏、吸收率低，影響機體有效的消化吸收。因此，添加乳酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣對脂質體外消化進行模擬，有助于提高對添加鈣脂質消化功能和控制遞送脂肪酸食物乳劑配制的理解。

圖6 乳清蛋白-酪蛋白6∶4、CaCl2 20 mmol/L乳液體外模擬胃消化（A）和腸消化（B）過程的FFA釋放率Fig. 6 Percentage of FFA released from emulsion made with a 6:4 mixture of whey protein and casein as emulsifier and 20 mmol/L CaCl2 during in vitro simulated gastrointestinal digestion

如圖6A所示，在胃消化10 min內，氯化鈣和乳酸鈣FFA釋放速率緩慢增加，而后驟然加快，在30 min時達到最大值，即氯化鈣和乳酸鈣FFA釋放率分別為3.01%和2.98%。相反，碳酸鈣和檸檬酸鈣在整個胃消化階段都相對平緩，幾乎未進行脂質消化。

在腸消化階段，由圖6B可知，隨著消化的進行，無論是可溶性鈣還是難溶性鈣FFA釋放程度均隨消化時間的延長而增加，可能是因為脂質分解產生FFA使pH值降低，促使Ca2＋從不同鈣鹽中釋放[10]。在30 min消化內，不同鈣鹽的FFA釋放速率和程度次序為：檸檬酸鈣＞氯化鈣＞乳酸鈣＞碳酸鈣。消化40 min時，氯化鈣和乳酸鈣的FFA釋放速率和程度大體一致，趨近飽和。檸檬酸鈣FFA釋放率達到82.42%，為4 組鈣鹽中消化速率和程度最高。碳酸鈣的FFA釋放速率和程度在4 組不同鈣鹽中最低，主要因為碳酸鈣是難溶性鈣鹽，在腸消化過程中Ca2＋釋放少，但在整個腸消化過程中FFA釋放率仍有39.14%，說明與不添加鈣的乳液相比，所有鈣鹽均在一定程度上提高脂質消化的速率和程度。同時結果也表明，通過添加鈣來促進脂質消化與鈣鹽在水中的溶解度密切相關[30]。

3 結 論

本實驗主要目的是研究不同鈣濃度及不同鈣鹽對OPO型油脂乳液體外模擬消化的影響，為設計和研發嬰幼兒配方奶粉提供理論依據和技術支持。研究結果表明，在同種乳化劑配比、不同CaCl2濃度條件下，OPO型油脂乳液的FFA釋放速率及程度均隨CaCl2濃度的增加而增加。體外模擬OPO型油脂乳液脂質消化動力學數據顯示，乳清蛋白-酪蛋白配比6∶4乳液，消化產物FFA和MAG主要由PA和OA組成。消化產物FFA中的PA含量小于OA含量，MAG脂肪酸成分含量與之相反。這主要與OPO型油脂構型有關，利于嬰幼兒消化吸收。而研究中考察的乳酸鈣、檸檬酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣對乳液脂質消化的影響與其他研究者報道結果一致，即檸檬酸鈣＞氯化鈣＞乳酸鈣＞碳酸鈣。產生這種結果主要與不同鈣鹽在水相中的溶解度有關，溶解度高則解離的Ca2＋多。在脂質消化過程中，解離的Ca2＋作用甘油三酯水解物FFA，可增加消化酶作用脂滴的位點數目，提高OPO型油脂乳液消化率。因此，探討不同鈣濃度及不同鈣鹽對OPO型油脂乳液體外模擬消化的影響具有一定的現實意義。