γ-聚谷氨酸對羅非魚皮酶促溶性膠原自聚集性的影響

閆鳴艷，趙曉晨，楊 蕭，許 豪，安祥生，李銀平*

（青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042）

膠原是動物體內含量最多分布最廣的一類結構蛋白，約占總蛋白量的30%[1]，廣泛分布于動物的皮膚、骨骼、軟骨、肌腱、角膜等部位[2]。其具有良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等功能[3]，因而在生物材料、組織工程、醫藥、食品和化妝品等領域具有非常廣泛的應用。目前使用的膠原主要來源于豬、牛等陸生哺乳動物，近年來由于瘋牛病、口蹄疫等人畜交叉流行病的頻發，豬和牛中來源膠原的應用受到了限制[4]。在這種情況下，水產膠原由于原料豐富、易于提取、低抗原性、低致敏性、沒有傳染病危險等而受到廣泛的關注[5]。羅非魚（Oreochromis niloticus）是我國最常見的淡水魚之一，近年來，其養殖產業發展迅速，出口量也逐年增長，由此產生大量魚皮、魚骨、魚頭等副產物[6]，其中魚皮約占4.0%，而魚皮干物質的70%以上為膠原[7]。目前羅非魚皮膠原已被加工成多肽應用于食品、化妝品等領域，然而近年來水產膠原基生物材料領域受到廣泛關注，將羅非魚皮膠原開發成生物材料是提高水產加工附加值的另一條有效途徑。

自聚集性是膠原的內在屬性，利用這一屬性膠原能夠在體外形成類似于天然膠原纖維結構的纖維網絡[8]，這也是構建膠原基生物材料及改善其性能最常用的技術手段[9]。膠原自聚集性易受外界因素的影響，如膠原濃度、溶液pH值、自聚集溫度、離子強度、紫外線、電場以及外源物質等[3]。在生物體內，膠原易與多糖類成分一起構成一種有序的網絡結構——細胞外基質，對于機體細胞的生長、發育和遷移具有非常重要的意義[10]，而在體外，多糖也經常與膠原一起制備復合生物材料，因此探討多糖類物質對膠原自聚集性影響的研究較多，如Tian Huilin等[11]探討了硫酸軟骨素對體外牛皮膠原纖維的重建的影響，閆鳴艷[7]研究了海藻酸鈉、硫酸軟骨素、透明質酸和殼聚糖對羅非魚皮膠原自聚集性的影響。然而，對于其他構建生物材料的氨基酸類生物大分子對膠原自聚集性影響的報道較少。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-谷氨酰鍵聚合而成的直鏈狀氨基酸聚合物，表現良好的水溶性和生物降解性，并且安全無毒，在生物醫學領域具有廣闊的應用前景[12-13]。該物質可與其他物質復合形成新型材料，如Otani等[14]利用明膠、聚谷氨酸和碳化二亞胺制備了一種快速固化膠水，具有較好的止血效果；Shi Lu等[15]利用γ-PGA和絲膠蛋白制備了一種新型水凝膠，用作創傷敷料。本研究將著重探討γ-PGA對羅非魚皮酶促溶性膠原自聚集性及膠原水凝膠微觀結構和性能的影響，相關研究成果能夠為水產膠原基生物材料的研究和開發提供理論基礎，同時對于食品營養成分的包埋緩釋也具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮由青島廠家提供，－20 ℃運抵實驗室保存，實驗時4 ℃解凍。

胃蛋白酶、I型膠原酶 美國Sigma公司；γ-PGA（分子質量為106Da） 山東福瑞達醫藥集團有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、叔丁醇、乙醇、Tris、濃鹽酸、考馬斯亮藍、十六烷基三甲基溴化銨均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CT14RD冷凍離心機 天美（中國）科學儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；722N可見分光光度計、精密PHS-3C酸度計上海佑科儀器儀表有限公司；DKB-501S電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；S-4800掃描電鏡 日本Hitachi公司；CT3質構儀 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促溶性膠原的制備

酶促溶性膠原（pepsin-solubilized collagen，PSC）的制備參照Huang Yuru等[16]的方法。

1.3.2 膠原自聚集動力學

參照閆鳴艷[7]的方法。稱取一定量膠原于4 ℃攪拌溶解于0.5 mol/L的醋酸溶液得質量濃度為1 mg/mL的溶液，20 000×g離心后取上清液。將該上清液與40 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）于冰浴中等體積混合，混合均勻后調節溶液pH 7.4，立即于28 ℃水浴中自聚集。

以40 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）為溶劑配制質量濃度為1 mg/mL的γ-PGA溶液，20 000×g離心后取上清液。將該溶液與PSC溶液和磷酸緩沖液在冰浴中按照一定比例混合，使γ-PGA與PSC的質量百分比分別為20%、40%、60%、80%和100%，磷酸緩沖液和膠原的終濃度分別為20 mmol/L和0.5 mg/mL，混合均勻后調節溶液pH 7.4，于28 ℃水浴中自聚集。

每2 min采用分光光度計測定溶液在400 nm波長處的吸光度，以第0分鐘時的膠原溶液為空白。依據文獻[7,17]的方法對膠原自聚集動力學曲線進行分析，以ln[（Ae－At）/（Ae－A0）]對時間作圖，針對不同階段數據進行一元線性回歸分析，所得斜率即為膠原自聚集速率常數。其中，At、Ae和A0為自聚集PSC溶液在時間t、平衡階段和第0小時于400 nm波長處的吸光度。

1.3.3 自聚集比率

膠原自聚集完全后20 000×g離心30 min，收集上清液。采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量；γ-PGA含量測定采用十六烷基三甲基溴化銨法[18]。自聚集比率即為上清液中某成分（PSC、γ-PGA）的降低比率，計算如式（1）所示：

1.3.4 掃描電鏡觀察

參照王響英等[19]的方法。膠原水凝膠于蒸餾水中浸泡脫鹽24 h（每8 h更換一次蒸餾水），在2%甲醛溶液中固定12 h后依次用30%、50%、70%、80%和90%叔丁醇-乙醇溶液脫水，最后于叔丁醇中脫水3 次，每次15 min。然后將脫水凝膠置于4 ℃條件下固化，凍干后固定于樣品臺上，真空噴金處理，加速電壓為10 kV在掃描電鏡下觀察樣品的微觀結構。

1.3.5 凝膠強度的測定

膠原（4 mg/mL）在50 mL燒杯中自聚集形成高度為45 mm的水凝膠后，采用質構儀測定其凝膠強度。采用直徑為10 mm的圓柱形平頭沖頭（TA-10），測試速率為0.5 mm/s，壓力為4.5 g，測定水凝膠被壓縮4 mm時的壓力。凝膠強度計算如式（2）所示：

式中：G為凝膠強度/（kN/m2）；F為壓力/g；r為圓柱形平頭沖頭半徑/mm。

1.3.6 耐酶性分析

將I型膠原酶（≥125 U/mg）溶于50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，調節pH 7.4，使酶添加量為10 U/mL。精確稱取一定質量（m0）的樣品于酶液中，使酶總活力與樣品質量比為600 U/mg，于37 ℃放置3.5 h，取出后立即在冰浴中終止反應，用蒸餾水脫鹽后干燥稱量其質量（m1）。降解率計算如式（3）所示：

1.3.7 熱穩定性分析

膠原水凝膠熱穩定性的測定參照Yunoki等[20]的方法。將在10 mL試管中高度為（40±3）mm的水凝膠放置于溫度為30 ℃的水浴中，保持30 min，觀察水凝膠的變化，然后以1 ℃為間隔依次升溫至50 ℃，并在每個溫度條件下保溫30 min，當觀察到水凝膠開始融化時記錄溫度，此時溫度即為水凝膠的熱變性溫度。

1.4 數據處理

數據統計采用Origin 7.5進行ANOVA單因素方差分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 γ-PGA對羅非魚皮PSC自聚集動力學的影響

圖1 γ-PGA對羅非魚皮PSC自聚集動力學曲線（a）及線性擬合關系（b）的影響Fig. 1 Effect of γ-PGA on the kinetic curve (a) and linear fi tting relationship (b) of PSC self-assembly from tilapia skin

表1 γ-PGA對羅非魚皮PSC自聚集速率常數的影響Table 1 Effect of γ-PGA on the rate constant of PSC self-assembly from tilapia skin

在不同含量γ-PGA存在的條件下，羅非魚皮PSC的自聚集動力學曲線均為S型（圖1a），表明膠原仍然表現較好的自聚集能力，但是當γ-PGA/PSC達到60%及以上時，膠原自聚集動力學曲線線性增長階段斜率逐漸降低，說明膠原自聚集速率減緩，原因主要是γ-PGA的等電點偏酸性，而膠原自聚集pH 7.4，在此條件下γ-PGA帶大量的負電荷，其結合到PSC上后使得膠原所帶負電荷增加、分子間靜電斥力增大[21]。依據文獻[7,17]的自聚集動力學理論對膠原自聚集動力學曲線進行分析（圖1b和表1），結果表明在γ-PGA存在的條件下，膠原的自聚集過程仍然包含兩個階段[11]：第1階段（成核階段），膠原分子結構發生變化形成晶核，但吸光度并未顯著增加；第2階段（生長階段），在晶核的基礎上膠原分子進一步生長直至形成膠原纖維甚至纖維束，進而形成宏觀三維網絡結構[22]，表現為吸光度顯著增加直至穩定。然而，在γ-PGA存在的條件下，膠原的自聚集動力學參數發生了變化。通過對所得數據進行分析，對于純膠原來說，第1和第2自聚集階段的分界點在10 min時，隨著γ-PGA含量的增加，分界點依次為12、12、16、18 min和18 min；采用一元線性回歸方法對每一階段的數據進行擬合，發現隨著γ-PGA含量的增加，膠原的成核時間逐漸延長，第1階段的速率常數顯著降低，主要與γ-PGA帶大量的負電荷有關；而第2階段的速率常數呈現先增加后降低的趨勢，原因可能是γ-PGA有大量的側鏈羧基，有利于增加膠原間的結合位點，因而纖維生長的速率常數是增加的，但是隨著其含量的增加，負電荷帶來的斥力是主要影響因素，因而速率常數降低。由表1還可以看出，第1階段的速率常數遠低于第2階段，因此成核階段是影響膠原自聚集性的速控階段。圖2為γ-PGA對膠原自聚集比率的影響，可以看出當γ-PGA/PSC不高于80%時，隨著其含量的增加，膠原自聚集比率沒有顯著變化，然而當γ-PGA/PSC進一步增加到100%時，其值顯著降低；而對于γ-PGA來說，其自聚集比率是隨著含量的增加而顯著增加的，可能與γ-PGA含有大量側鏈羧基有關。

圖2 γ-PGA對羅非魚皮PSC自聚集比率的影響Fig. 2 Effect of γ-PGA on the reconstruction rate of PSC self-assembly from tilapia skin

2.2 γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠微觀結構的影響

羅非魚皮PSC自聚集后能夠形成外觀為白色的水凝膠，γ-PGA對水凝膠微觀結構的影響如圖3所示，可以看出在不同含量的γ-PGA存在的條件下，水凝膠均呈現三維纖維網絡結構，與豬皮[10]、牛皮[11]、羅非魚鱗[23]、江鼠大鰭鳠魚皮[24]、草魚皮和鱗[25]等膠原水凝膠結構類似。但是在三維網絡結構中，膠原纖維間的致密度不同。當γ-PGA/PSC增加到80%時，膠原纖維致密度呈現增加趨勢，然而當其進一步增加到100%時，纖維間的致密度下降，原因可能是在γ-PGA含量比較低的時候，其與PSC相互作用導致交聯位點增加，但是隨著γ-PGA的增多，大量的分子與PSC相互作用從而屏蔽了膠原分子本身的交聯位點。

圖3 γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠微觀結構的影響Fig. 3 Effect of γ-PGA on the microstructure of PSC gel from tilapia skin

2.3 γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠性能的影響

圖4 γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠的凝膠強度和耐酶性的影響Fig. 4 Effect of γ-PGA on the gel strength and enzymatic resistance of PSC hydrogels from tilapia skin

膠原自聚集水凝膠結構類似于天然細胞外基質，但是純膠原水凝膠在凝膠強度、熱穩定性、耐酶性等方面均存在不足，限制了其在生物材料等領域的應用[26]。因此本實驗探討γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠性能的影響，結果如圖4所示。當γ-PGA/PSC增加到80%時，膠原水凝膠的凝膠強度呈現增強趨勢，但是當其進一步增加到100%時，其凝膠強度顯著下降，這主要與凝膠的三維網絡結構有關，如前所述，當γ-PGA/PSC增加到80%時，膠原纖維致密度呈現增加趨勢，然而當其進一步增加到100%時，纖維間的致密度下降。同時發現γ-PGA對膠原水凝膠的耐酶性非常不利，隨著其含量的增加，水凝膠的酶降解率顯著增加。前人研究表明I型膠原酶首先降解膠原螺旋區的775位甘氨酸殘基和776位亮氨酸殘基形成的肽鍵[27-28]，由此推測γ-PGA的引入導致了膠原纖維中氨基酸殘基的位置發生了改變，Gly-Leu被暴露出來導致更容易被膠原酶所降解；降解率顯著增加還可能與三維網絡結構中膠原纖維間作用力較弱有關。此外，實驗中對γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠熱穩定性的影響進行了探討，結果表明隨著γ-PGA含量的增加，膠原水凝膠熱穩定性并未發生顯著變化，均在（47±1）℃開始融化，可能是膠原纖維間作用力較弱導致的。綜上所述，γ-PGA對羅非魚皮PSC水凝膠的耐酶性和熱穩定性并未顯示積極的影響，因此參照其他文獻[29-30]，在下一步研究中將引入交聯等技術改善復合水凝膠的性能。

3 結 論

γ-PGA對羅非魚皮PSC自聚集動力學具有顯著影響，能夠延緩膠原晶核的形成，但是在γ-PGA/PSC不大于80%時可加快膠原纖維的生長。自聚集后，膠原能夠形成外觀為白色的水凝膠，其微觀結構為三維纖維網絡，γ-PGA能夠影響到纖維的致密度，在γ-PGA/PSC增加到80%時，網絡致密度表現增加趨勢，相對應的凝膠強度也表現類似趨勢。然而，γ-PGA對膠原水凝膠的耐酶性和熱穩定性并未表現積極的影響，因此下一步研究將引入交聯等技術進一步改善水凝膠的性能。