菊粉對(duì)小麥面筋蛋白理化性質(zhì)的影響

穆婉菊，馮 佳，李秀秀，李書(shū)紅,2，陳 野,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

菊粉存在于洋姜和菊苣中，主要作為一種儲(chǔ)存碳水化合物，可以成為人類(lèi)日常飲食的一部分[1-2]。菊粉是由D-呋喃果糖分子以β-(2→1)糖苷鍵連接而成的末端有一個(gè)葡萄糖殘基的果聚糖，聚合度通常為2～60。根據(jù)聚合度不同，可以將菊粉分為長(zhǎng)鏈菊粉、天然菊粉和短鏈菊粉[3]。菊粉具有多種生理功能，如改善腸道微環(huán)境、控制血脂、低熱量控制體質(zhì)量、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)維生素合成、調(diào)節(jié)血糖水平和抗癌效果等[4-6]。由于其良好的生理功能和理化性質(zhì)，菊粉常被用作一種益生元、脂肪替代品、糖替代品、質(zhì)地修飾劑以及功能性食品，可以改善人體健康狀況[7-8]。

目前，在面粉工業(yè)中，各種膳食纖維，如大豆纖維、麥麩纖維、米糠纖維、燕麥纖維、殼聚糖纖維和果蔬纖維等已被應(yīng)用于面包、餅干、蛋糕、饅頭和面條中[9-10]。然而，限制膳食纖維在面粉中被廣泛應(yīng)用的最主要原因是這類(lèi)常見(jiàn)的膳食纖維絕大多數(shù)水溶性低，粒徑粗大，色澤和食品加工性能差，即使低添加量也會(huì)給最終產(chǎn)品品質(zhì)帶來(lái)嚴(yán)重的不良影響，尤其是在口感、色澤和質(zhì)構(gòu)特性等方面[4]。與傳統(tǒng)的膳食纖維相比，菊粉在面制品中的應(yīng)用具有自身的優(yōu)勢(shì)。目前，將菊粉應(yīng)用于面制品中的基礎(chǔ)性研究鮮有報(bào)道。面筋蛋白作為面制品中的重要組分，通過(guò)對(duì)其性質(zhì)的基礎(chǔ)性研究可以更好地了解菊粉對(duì)面制品品質(zhì)的影響。

小麥面筋蛋白是從小麥面粉中經(jīng)過(guò)分離、提取和干燥得到，其含蛋白質(zhì)高達(dá)80%以上[5]。小麥面筋蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成，麥谷蛋白與面筋彈性有關(guān)，而醇溶蛋白與面筋的黏性有關(guān)[13-15]。小麥面筋蛋白的質(zhì)量影響著小麥面團(tuán)黏彈性和加工品質(zhì)，因此對(duì)其性質(zhì)的研究具有十分重要的意義[6]。本研究將菊粉加入到小麥面筋蛋白中，對(duì)面筋蛋白乳化特性、熱特性和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究并對(duì)其性質(zhì)變化與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行深入探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然菊粉（純度＞90%） 重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司；面筋蛋白 鄭州市豫香食品發(fā)展有限公司。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純） 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FD-10冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；DSC-60A差示掃描量熱儀 日本島津有限公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀、JSM-IT300LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 菊粉和小麥面筋蛋白復(fù)合物的制備

每個(gè)樣品干質(zhì)量為10 g，將不同質(zhì)量的菊粉充分溶解于20 mL蒸餾水中，加入面筋蛋白分散于溶液中，使得菊粉添加量分別為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%和20%。混合物在40 ℃保溫2 h，以此來(lái)模擬在面團(tuán)中的反應(yīng)。反應(yīng)充分的混合物進(jìn)行冷凍干燥處理24 h，取出后研磨成粉末，過(guò)100 目篩。

1.3.2 蛋白質(zhì)乳化特性的測(cè)定

取0.5 g樣品分散于20 mL蒸餾水中，振蕩30 min，4 000 r/min離心15 min。取上清液15 mL加入大豆油5 mL，高速剪切10 000 r/min均質(zhì)1 min。制備好的乳狀液分別于0 min和10 min時(shí)從乳液底部吸取500 μL，加入到5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉溶液中，混合均勻后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度A0和A10，以0.1%十二烷基硫酸鈉溶液作為對(duì)照。乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：N為稀釋倍數(shù)；θ為油相體積/mL；L為比杯厚度/cm；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.3 蛋白質(zhì)熱力學(xué)特性分析

采用差示掃描量熱法對(duì)不同菊粉添加量的小麥面筋蛋白進(jìn)行熱力學(xué)特性分析。稱(chēng)取3 g左右的樣品放入固體坩堝中，以空坩堝作為對(duì)照，放入差示掃描量熱儀進(jìn)行測(cè)量。所有測(cè)量過(guò)程都以10 ℃/min的速率進(jìn)行加熱，從30 ℃升溫至160 ℃，均重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)巰基及二硫鍵的測(cè)定

溶液的配制：磷酸鹽緩沖液：取4 g NaCl、0.1 g KCl、0.71 g Na2HPO4和0.135 g NaH2PO4充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至500 mL，pH值為7.4。Tris-Gly-Urea緩沖液：取5.209 g三羥甲基氨基甲烷、3.378 g甘氨酸、0.7445 g乙二胺四乙酸二鈉和240.24 g尿素充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至500 mL，pH值為8.0。Tris-Gly緩沖液：取10.418 g三羥甲基氨基甲烷、6.756 g甘氨酸和1.489 g乙二胺四乙酸二鈉充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至1 000 mL，pH值為8.0。Ellman試劑：將20 mg DTNB溶解于5 mL Tris-Gly緩沖液中。

自由巰基的測(cè)定：將60 mg樣品分散于1 mL磷酸鹽緩沖液中，向混合體系中加入5 mL Tris-Gly-Urea緩沖液后充分振蕩，再加入50 μL Ellman試劑后避光靜置1 h，隨后3 000 r/min離心10 min。取上清液用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)量吸光度（A412nm）。按式（3）計(jì)算自由巰基含量：

式中：7 3.5 3為E l l m a n試劑的摩爾消光系數(shù)/（mol/mL）；D為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

總巰基測(cè)定：即稱(chēng)取樣品120 mg分散于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，加入4 μLβ-巰基乙醇處理2 h后，加入4 mL 12%三氯乙酸溶液靜置1 h后，10 000 r/min離心20 min。用12%三氯乙酸溶液洗滌沉淀3 次，每次洗滌后10 000 r/min離心10 min。去除上清液，加入2 mL Tris-Gly緩沖液和80 μL Ellman試劑，進(jìn)行劇烈振蕩后25 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心30 min。以不加Ellman試劑為對(duì)照，取上清液稀釋10 倍后測(cè)定波長(zhǎng)412 nm處吸光度。總巰基含量計(jì)算同式（3），并按式（4）進(jìn)行二硫鍵含量計(jì)算：

1.3.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，準(zhǔn)確稱(chēng)量1 mg樣品，將150 mg溴化鉀與樣品混合，充分研磨使其混合均勻。隨后混合物被壓縮并放置在紅外分析儀上，以4 cm－1的分辨率記錄紅外光譜，掃描次數(shù)為16 次。所有測(cè)量均重復(fù)進(jìn)行3 次。

傅里葉變換紅外光譜圖的處理：利用軟件OMNIC 8.0進(jìn)行分析，首先進(jìn)行基線校正，然后傅里葉自去卷積，選擇合適的峰寬（24～26）和增強(qiáng)度（2.9～3.1），進(jìn)行高斯函數(shù)找峰，擬合峰處理直至峰特征穩(wěn)定，確定各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算各子峰面積的相對(duì)含量。

1.3.6 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析

使用掃描電子顯微鏡觀察蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將冷凍干燥后的樣品破碎，使用雙面膠將蛋白凍干樣的斷面朝上，固定在樣品臺(tái)上，使用濺射涂布機(jī)對(duì)樣品的斷面進(jìn)行噴金處理使樣品導(dǎo)電，觀察斷面的微觀結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)為150 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖；采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉添加量對(duì)小麥面筋蛋白乳化特性的影響

圖1 菊粉添加量對(duì)蛋白質(zhì)乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 1 Effects of inulin on emulsifying activity index (A) and emulsion stability index (B) of wheat gluten protein

小麥蛋白的乳化活性與面制品的柔軟度有關(guān)，蛋白質(zhì)的乳化活性越大，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，因此乳化活性可影響最終面制品的口感[7]。如圖1A所示，菊粉的添加顯著增加了蛋白質(zhì)的乳化活性，這是由于菊粉有較強(qiáng)吸水性，改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部水分分布，破壞了蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，促進(jìn)蛋白質(zhì)中疏水基團(tuán)相互作用，使蛋白質(zhì)乳化活性增強(qiáng)。另一方面，菊粉的添加可以加強(qiáng)蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團(tuán)與水相互作用，使蛋白質(zhì)溶解度增加，從而使乳化活性增強(qiáng)。當(dāng)菊粉添加量低于10.0%時(shí)，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)乳化活性升高，提高14.4%。當(dāng)菊粉添加量繼續(xù)增大，即菊粉添加量超過(guò)10%時(shí)，菊粉吸水能力達(dá)到飽和，對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響很小，因此對(duì)乳化活性影響也較小。

如圖1B所示，與乳化活性結(jié)果類(lèi)似，低添加量菊粉對(duì)乳化穩(wěn)定性的影響較為顯著，尤其當(dāng)菊粉添加量為7.5%時(shí)，蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性提高了18.7%。有研究表明菊粉可提高麥醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性但是會(huì)降低麥谷蛋白的乳化穩(wěn)定性，但菊粉對(duì)小麥蛋白乳化穩(wěn)定性的影響中麥醇溶蛋白起主導(dǎo)作用[8]。本研究得到相同的結(jié)果，菊粉可提高小麥蛋白的乳化穩(wěn)定性，此作用尤其在菊粉添加量較低時(shí)更為明顯。

2.2 菊粉添加量對(duì)小麥面筋蛋白熱力學(xué)特性的影響

表1 菊粉添加量對(duì)小麥蛋白熱力學(xué)特性的影響Table 1 Effect of inulin on thermodynamic property of wheat gluten protein

蛋白質(zhì)變性過(guò)程中會(huì)涉及吸熱反應(yīng)和放熱反應(yīng)，焓變值代表反應(yīng)過(guò)程中吸放熱情況，焓變值的大小決定蛋白質(zhì)變性的程度，而變性溫度可以反映小麥蛋白的熱穩(wěn)定性[9]。如表1所示，純小麥蛋白的熱變性溫度為79.32 ℃，隨著菊粉添加量的增加，小麥蛋白的熱變性溫度升高，當(dāng)添加量為12.5%時(shí)達(dá)到最大值，變性溫度為（90.29±1.17）℃。這說(shuō)明添加菊粉可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，可能是由于菊粉側(cè)鏈大量羥基，與蛋白質(zhì)的親油基團(tuán)通過(guò)氫鍵作用形成緊密的結(jié)構(gòu)造成的。有研究也得到多糖可以改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的相關(guān)結(jié)論[10]。

小麥蛋白的焓變值在添加菊粉時(shí)逐漸下降，但當(dāng)菊粉添加量較低時(shí)，焓變值的變化并不顯著，當(dāng)添加量為12.5%時(shí)，焓變值顯著降低。本實(shí)驗(yàn)中菊粉加入到蛋白質(zhì)中進(jìn)行熱處理，導(dǎo)致美拉德交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終使焓變值降低。

2.3 小麥面筋蛋白巰基及二硫鍵含量測(cè)定

二硫鍵可使蛋白質(zhì)肽鏈空間結(jié)構(gòu)更加緊密，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，相反，二硫鍵斷開(kāi)會(huì)造成蛋白質(zhì)黏度下降，影響食品加工過(guò)程中面制品的品質(zhì)[21-22]。蛋白質(zhì)中的二硫鍵可以經(jīng)過(guò)還原反應(yīng)形成巰基后，蛋白質(zhì)構(gòu)象將變得松散，但在一定條件下自由巰基經(jīng)重新氧化，又可重新形成二硫鍵，二硫鍵可按照原來(lái)的配對(duì)進(jìn)行組合，這樣形成的蛋白質(zhì)可與天然蛋白質(zhì)一樣，既有正確的空間構(gòu)象，又具有原來(lái)蛋白質(zhì)的生物活性。

表2 菊粉添加量對(duì)小麥蛋白自由巰基及二硫鍵含量的影響Table 2 Effect of inulin on disulfide and free sulfhydryl contents of wheat gluten protein

如表2所示，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)自由巰基含量下降，二硫鍵含量增加，當(dāng)菊粉添加量達(dá)到20%時(shí)，蛋白質(zhì)自由巰基含量下降了67.73%，二硫鍵含量增加了2.22 倍，這些變化都表明自由巰基正逐步向二硫鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。在滿(mǎn)足二硫鍵形成的化學(xué)條件下，二硫鍵的形成原本是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，但菊粉的加入可能會(huì)加大這種隨機(jī)事件的概率，導(dǎo)致蛋白質(zhì)二硫鍵進(jìn)一步形成。菊粉應(yīng)用于面制品加工中，可對(duì)面團(tuán)柔韌性有積極影響。

2.4 菊粉添加量對(duì)小麥面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是由多種力共同維持的，其中最重要的作用力是氫鍵，傅里葉變換紅外光譜對(duì)氫鍵強(qiáng)度十分敏感，因此常作為分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法[11]。傅里葉變換紅外光譜圖中酰胺I帶不同的吸收波數(shù)分別對(duì)應(yīng)著蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)（1 650～1 660 cm－1）、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（1 660～1 700 cm－1）、β-折疊結(jié)構(gòu)（1 610～1 640 cm－1）和無(wú)規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm－1）[12]。

小麥蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)是一個(gè)穩(wěn)定牢固的彈性結(jié)構(gòu)，它與面制品的品質(zhì)有關(guān)，主要影響面團(tuán)的彈性和硬度[13]。如表3所示，添加菊粉對(duì)小麥蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量影響不顯著。隨著菊粉添加量增加，小麥蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量升高，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低。由于菊粉強(qiáng)大的吸水性，導(dǎo)致整個(gè)體系中自由水減少，這種水合環(huán)境的改變最直接的結(jié)果就是導(dǎo)致維持β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氫鍵被破壞，使β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例降低。同時(shí)，菊粉的存在還使一些小分子蛋白在非共價(jià)相互作用下發(fā)生聚集，導(dǎo)致β-折疊結(jié)構(gòu)增多。有研究也得出相似結(jié)論，新形成的β-折疊結(jié)構(gòu)屬于反平行β-折疊結(jié)構(gòu)[14]。由于菊粉可以與水分子形成氫鍵，使得體系中水分結(jié)合的更加緊密，進(jìn)而使C＝O與水形成的氫鍵增強(qiáng)，小麥蛋白中無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例也隨之增加[15]。

表3 菊粉添加量對(duì)小麥蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of inulin on secondary structures of wheat gluten protein

2.5 菊粉添加量對(duì)小麥面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖2 菊粉添加量對(duì)蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of inulin on microstructure of wheat gluen protein

從圖2可以看出，不添加菊粉的小麥蛋白結(jié)構(gòu)存在孔隙，隨著菊粉的加入，孔隙逐漸消失，結(jié)構(gòu)逐漸致密。添加菊粉后的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與蛋白質(zhì)乳化活性增強(qiáng)有關(guān)，菊粉的添加使面筋蛋白中麥醇溶蛋白親水作用增強(qiáng)，這使面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到強(qiáng)化?？梢杂^察到添加10%菊粉的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最致密，這與菊粉添加量為10%時(shí)，蛋白質(zhì)乳化活性較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。另外，面筋蛋白中二硫鍵含量的增加也是造成面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固的原因。

當(dāng)菊粉添加量達(dá)到7.5%時(shí)，可以觀察到菊粉附著到面筋蛋白表面上，隨著菊粉添加量進(jìn)一步增加，覆蓋程度也進(jìn)一步加強(qiáng)。當(dāng)菊粉添加量達(dá)到20%時(shí)，顯微圖像中已經(jīng)基本觀察不到孔隙的存在。菊粉與蛋白質(zhì)間存在著氫鍵和疏水鍵，這些局部作用力在2 種物質(zhì)邊界處起到連接作用[16]。菊粉和某些蛋白質(zhì)如酪蛋白和β-乳球蛋白的疏水作用還可在溶液中形成一個(gè)具有疏水中心的螺旋旋渦，這也可能對(duì)蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響[29-30]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同菊粉添加量對(duì)小麥蛋白多種理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。菊粉可改善小麥蛋白乳化性能，較低添加量的菊粉對(duì)小麥蛋白乳化性能的影響較顯著；小麥蛋白的熱變性溫度在添加菊粉之后升高，焓變值降低，在一定程度上說(shuō)明菊粉可以提高小麥蛋白熱穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)中自由巰基與二硫鍵之間可通過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)中自由巰基逐步向二硫鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，這使得蛋白分子空間結(jié)構(gòu)更加緊密；對(duì)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)而言，菊粉對(duì)小麥蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例影響不顯著，但會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲所占比例升高，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量比降低；對(duì)于蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)而言，菊粉使蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密和穩(wěn)定。總之，菊粉可以改善蛋白質(zhì)多種理化性質(zhì)，此研究為后續(xù)菊粉作為一種膳食纖維添加到面制品的研究中提供了理論支持。