基于多重光譜技術(shù)的木糖醇與牛乳酪蛋白相互作用及對(duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)的影響

孔繁華，曹雪妍，康世墨，李瑋軒，關(guān)博元，李墨翰，楊 梅，岳喜慶*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

牛乳酪蛋白（casein，Cs）具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且由于其疏水性低、凈電荷高，在天然條件下及加工過(guò)程中均呈現(xiàn)出獨(dú)特的展開結(jié)構(gòu)[1-2]，引起了人們研究它與花色苷、多酚、藥物等物質(zhì)相互作用的極大興趣，并且有研究發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用會(huì)影響Cs的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。例如，He Zhiyong等[3]報(bào)道α-Cs和β-Cs分別通過(guò)親水（范德華力或氫鍵）和疏水相互作用與麥芽糖-3-O-葡萄糖苷結(jié)合，并且對(duì)其熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性有積極作用；Bi Hongna等[4]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸四環(huán)素對(duì)牛乳β-Cs、α-乳白蛋白的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅，分別通過(guò)靜電引力和氫鍵而發(fā)生結(jié)合相互作用，使兩種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，且表面疏水性也有所降低。Haratifar等[5]發(fā)現(xiàn)茶多酚與Cs相互作用形成的復(fù)合物能夠影響凝乳酶誘導(dǎo)的牛奶凝膠化，且影響是有濃度依賴性的。

木糖醇（xylitol，XY）是一種天然的多元醇，是良好的助溶劑，具有類似蔗糖的甜味能力，常見于水果和蔬菜中，在體內(nèi)消化時(shí)，能做到不引起胰島素含量上升，不給糖尿病患者的代謝增加負(fù)擔(dān)，還常被用作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，在醫(yī)藥工業(yè)和食品工業(yè)中都起著至關(guān)重要的作用[6-7]。目前已經(jīng)有大量研究表明XY等糖醇化合物能夠改善球狀蛋白質(zhì)的功能特性，例如熱穩(wěn)定性、膠凝性、起泡特性以及乳化穩(wěn)定性等，并且對(duì)它們起到穩(wěn)定和保護(hù)的作用。Pan Mingzhe等[8]研究發(fā)現(xiàn)XY等助溶劑能使大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加有序，而結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致SPI的發(fā)泡性和表面疏水性降低，溶解性增加；Kommineni等[9]研究了XY對(duì)低脂工藝奶酪功能特性的影響，發(fā)現(xiàn)加入XY后，低脂工藝奶酪的硬度顯著降低，流變性能等功能性質(zhì)有所提高。但相關(guān)研究尚未涉及XY與Cs的相互作用以及對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，因此明確XY與Cs的相互作用不僅可以顯著提高XY的生物利用率，還有可能改善Cs的功能性質(zhì)。

本研究旨在利用多重光譜相結(jié)合的技術(shù)研究XY與Cs的相互作用機(jī)制以及對(duì)Cs結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。擬采用熒光猝滅法研究XY對(duì)Cs的猝滅機(jī)制，判斷二者之間是否存在相互作用，并計(jì)算二者的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合距離以及相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)，探討二者的相互作用機(jī)制；利用同步熒光光譜法研究XY主要結(jié)合的氨基酸殘基；利用三維熒光光譜法研究XY對(duì)Cs中氨基酸殘基微環(huán)境極性的影響，進(jìn)而推測(cè)對(duì)Cs構(gòu)象的影響；采用傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜法分析評(píng)價(jià)Cs二級(jí)結(jié)構(gòu)及相對(duì)含量的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證XY與Cs相互作用的存在，此外還對(duì)復(fù)合物的乳化性和表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，從而為XY在乳制品中的添加及功能性乳基料的開發(fā)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆色拉油 益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司。C s（蛋白質(zhì)含量≥9 5.0%，相對(duì)分子質(zhì)量為50 000～37 5000）、XY（純度＞99%，相對(duì)分子質(zhì)量為152.1） 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4），NaOH、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600熒光光譜儀 日本日立公司；FT-IR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；RH basic2磁力攪拌器 廣州科儀實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；Cary 50紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；J-810圓二色譜儀日本Jasco公司；MP2002電子天平 上海舜宇科學(xué)儀器有限公司；冷凍真空干燥機(jī) 撫順康源保鮮技術(shù)發(fā)展公司；DK-S26數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；T18 basic高速分散器 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

參考趙煥焦等[10]的方法配制1 mg/mL的Cs儲(chǔ)備液；參考Chen Haiying等的方法[11]，略有改動(dòng)，配制XY溶液：稱取適量XY固體，溶于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，置于磁力攪拌器上攪拌30 min（確保充分溶解），定容，配制成0.1 mol/L的XY原溶液，再用Tris-HCl溶液將其稀釋到1×10－5mol/L，備用。Cs溶液和XY溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

取1 mL 1 mg/mL的Cs溶液和適量1×10－5mol/L的XY溶液于試管中，使最終Cs與XY濃度比為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，每次加入25 μL XY溶液，充分振蕩混合均勻，分別置于300、310 K和320 K的水浴鍋中加熱恒溫30 min，激發(fā)波長(zhǎng)選擇280 nm，狹縫均為5 nm，掃描300～450 nm的發(fā)射光譜。分別在波長(zhǎng)差Δλ為15 nm和60 nm條件下，掃描樣品在220～350 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。

三維熒光光譜在以下條件下進(jìn)行：初始激發(fā)波長(zhǎng)為200 nm，增量為5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)在200～450 nm之間，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將Cs和Cs與XY濃度比為1∶4的樣品溶液置于超低溫冰箱中預(yù)冷凍3～4 h，再置于冷凍真空干燥機(jī)中干燥24 h，獲得樣品粉末，將凍干樣品與KBr按照質(zhì)量比為1∶100混合，研磨均勻，置于模具中壓片，以KBr作為背景，對(duì)樣品的全波段（4 000～400 cm－1）進(jìn)行掃描，分辨率為4 cm－1，掃描次數(shù)為32 次。使用Omnic軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，然后用Origin作圖。

1.3.4 圓二色譜分析

用Jasco-815圓二色譜儀在25 ℃條件下測(cè)定樣品在遠(yuǎn)紫外區(qū)域（190～250 nm）的圓二色譜，以0.1 mol/L NaOH和0.05 mol/L Tris-HCl混合液為空白緩沖液，將緩沖溶液加入比色皿中，比色皿光徑為0.1 cm，測(cè)定遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜。掃描速率100 nm/min，數(shù)據(jù)間隔1.0 nm，帶寬2.0 nm，掃描3 次，取平均值得到最終的圓二色譜。

1.3.5 乳化性測(cè)定

取9 mL蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 mg/mL的復(fù)合物溶液與3 mL大豆油混合，10 000 r/min高速分散處理1 min形成均一的乳狀液，分別在0 min和10 min，用微量注射器從底部取50 μL液體，用0.1% SDS溶液（pH 7）稀釋100 倍，將上述的溶液充分混合均勻，均勻后測(cè)定樣品在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以SDS溶液為空白。乳化活力指數(shù)和乳化穩(wěn)定指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：EAI為乳化活力指數(shù)/（m2/g）；ESI為乳化穩(wěn)定指數(shù)/min；DF為稀釋因子，100；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為比色皿光徑（1 cm）；θ為油相體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A0、A10分別為0 min和10 min時(shí)的吸光度。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

采用熒光探針法，用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液將樣品稀釋成不同濃度的溶液，使溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0.01～0.1 mg/mL之間。取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品5 mL，加入25 μL的ANS溶液（用pH 7.4、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制成8 mmol/L的溶液），振蕩混合均勻，并于室溫下暗反應(yīng)處理5 min。在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm條件下，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)做3 次，采用Origin 9.0軟件和Excel作圖，用SPASS 7.8軟件進(jìn)行誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源性熒光光譜分析

圖1 XY的熒光光譜圖Fig. 1 fl uorescence spectrum of XY

圖2 Cs與XY相互作用的熒光猝滅圖（T=300 K）Fig. 2 Fluorescence quenching of the interaction between XY andCs(T = 300 K)

圖1 為同一條件下獲得的XY的發(fā)射光譜，圖中有兩個(gè)吸收峰，一個(gè)位于311 nm附近，一個(gè)位于362 nm附近，熒光強(qiáng)度都較弱，可以忽略不計(jì)，故不會(huì)對(duì)Cs的熒光發(fā)射光譜產(chǎn)生影響。

Cs自身含有3 種生色基團(tuán)——色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。當(dāng)在280 nm波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，普通具有熒光的蛋白質(zhì)分別在348、303、282 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)吸收峰，強(qiáng)度比約為Trp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5[12-13]。如圖2所示，純Cs溶液（曲線1）的最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）約在350 nm處，可以判斷促使Cs發(fā)熒光的主要是Trp殘基。

由圖2還可以看出，隨著XY濃度的不斷增加，Cs的熒光強(qiáng)度（F）不斷降低，當(dāng)Cs與XY的濃度比從1∶0達(dá)到1∶10時(shí)，F(xiàn)從1 974減少至382，XY對(duì)Cs的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了熒光猝滅作用，表明XY可能與Cs發(fā)生了相互作用。此外還發(fā)現(xiàn)，Cs的λmax從350 nm藍(lán)移到340 nm，可能是由于Cs中的Trp和Tyr是具有相對(duì)較強(qiáng)疏水性的氨基酸殘基，其熒光光譜對(duì)于周圍微環(huán)境的變化比較敏感，有研究表明，熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜藍(lán)移表明Trp殘基附近的微環(huán)境發(fā)生改變，紅移則對(duì)應(yīng)Tyr殘基附近微環(huán)境的改變[14]。因此可以說(shuō)明Cs與XY發(fā)生了相互作用，使Cs中Trp殘基附近的極性降低，使其處于更疏水的環(huán)境中[15]。類似研究結(jié)果如楊國(guó)平等[16]經(jīng)過(guò)研究表明XY能通過(guò)與人血清白蛋白的相互作用而對(duì)其產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。

2.2 XY與Cs的猝滅效應(yīng)

蛋白質(zhì)發(fā)生熒光猝滅的機(jī)理有兩種，動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。為區(qū)分猝滅機(jī)理，進(jìn)行了溫度實(shí)驗(yàn)。通常用Stern-Volmer曲線方程描述[17]：

式中：F0為Cs的熒光強(qiáng)度；F為加入XY后Cs的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)/（L/（mol·s））；CQ為XY濃度/（mol/L）；τ0為XY不存在時(shí)Cs的平均熒光壽命/（10－8s）。

圖3 300、310 K和320 K時(shí)XY對(duì)Cs熒光猝滅的Stern-Volmer方程Fig. 3 Stern-Volmer curves of fl uorescence quenching of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表1 不同溫度下XY與Cs的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv和雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)KqTable 1 Stern-Volmer quenching constants and bimolecular quenching constants of XY with Cs at three temperatures

根據(jù)式（3）用F0/F對(duì)CQ作圖，可以得到Cs與XY相互作用的Stern-Volmer曲線，如圖3所示，根據(jù)圖中的直線斜率可以計(jì)算出公式中的Ksv和Kq，結(jié)果見表1。F0/F與CQ呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，說(shuō)明在反應(yīng)過(guò)程中只存在一種猝滅機(jī)制。根據(jù)動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅對(duì)于溫度偏好的不同[18]以及結(jié)合表1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)溫度下的Ksv值隨著溫度的升高而變小，符合靜態(tài)猝滅的規(guī)律。而且XY對(duì)Cs猝滅的速率常數(shù)Kq大于生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/（mol·s），因此，可以判斷XY對(duì)Cs內(nèi)在熒光猝滅效應(yīng)的機(jī)制主要是通過(guò)與Cs形成新的復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[3]。表1中的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，說(shuō)明XY與Cs相互作用的Stern-Volmer曲線方程給出的結(jié)合模式是可靠的。張青等[19]研究左氟沙星與Cs的相互作用時(shí)也得出了相同的結(jié)論。

2.3 結(jié)合常數(shù)（KA）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）的計(jì)算

對(duì)于靜態(tài)猝滅過(guò)程，遵循下列公式[20]：

式中：F0、F、CQ同式（3），KA為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg[（F0－F）/F]對(duì)lgCQ作圖（根據(jù)式（4）），可以得到XY與Cs相互作用的雙對(duì)數(shù)回歸曲線（圖4）。

圖4 不同溫度下XY與Cs相互作用的雙對(duì)數(shù)回歸曲線Fig. 4 Linear plot of lg [(F0?F)/F] versus lgCQ of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表2 不同溫度下XY與Cs的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Binding constants and thermodynamic parameters of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

根據(jù)圖4中直線的斜率和截距可以計(jì)算出XY與Cs相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)KA，結(jié)果見表2。可以看出，XY與Cs之間至少存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合常數(shù)KA較大，數(shù)量級(jí)在106左右，隨著溫度的升高，KA逐漸降低，表明在結(jié)合過(guò)程中生成的復(fù)合物Cs-XY不穩(wěn)定，當(dāng)溫度升高時(shí)，復(fù)合物可能部分分解。KA和n的值都隨著溫度的升高而下降，與2.2節(jié)中Ksv的趨勢(shì)一致，再次證明該過(guò)程的猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅。Zhang Yezhong等[21]利用熒光光譜研究牛血清白蛋白與對(duì)氨基偶氮苯的相互作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)二者的結(jié)合常數(shù)KA隨著溫度的升高而逐漸變小，猝滅機(jī)制屬于生成了不穩(wěn)定復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)與作用力

小分子和蛋白質(zhì)等大分子之間的相互作用主要涉及4種結(jié)合力：疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。如果溫度變化范圍不太寬，可以將相互作用中的ΔH視為常數(shù)。根據(jù)Van’t Hoff方程（式（5））和熱力學(xué)關(guān)系（式（6））[22]計(jì)算?G、?H和?S：

式中：KA為溫度T條件下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））。

根據(jù)公式（5）以lnKA對(duì)1/T作圖，由直線的斜率和截距能分別求出熱力學(xué)參數(shù)焓變（?H）和熵變（?S），代入式（6）可以求得?G，結(jié)果見表2。從表2可以看出，XY與Cs相互作用的過(guò)程中?G＜0，表明該結(jié)合過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的；?H＜0，?S＞0，說(shuō)明Cs與XY之間的相互作用屬于放熱反應(yīng)，反應(yīng)中的主要作用力為靜電引力[23]，但是考慮?S＞0，所以也不排除疏水性相互作用在其中起作用[13]。An Xin等[17]對(duì)硫鳥嘌呤與人血清白蛋白相互作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)二者之間的結(jié)合類型也屬于自發(fā)的放熱反應(yīng)。

2.5 結(jié)合距離

根據(jù)福斯特能量轉(zhuǎn)移理論[24]，能量轉(zhuǎn)移效率E由式（7）給出：

式中：r為供體-受體間的距離/nm；R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離/nm。

式中：K2為與偶極子給體-受體的幾何形狀相關(guān)的取向因子，液體溶液中通常取2/3；n為介質(zhì)的折射率（1.336）；Φ為供體的熒光量子產(chǎn)額，取值為0.4；J為供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。這里的供體和受體分別為Cs和XY。J由式（9）給出：

式中：F（λ）為Cs在λ波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；ε（λ）為XY在λ波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)。從這些關(guān)系中，可以計(jì)算出J、R0和E，因此也可以計(jì)算出r的值。

圖5 Cs的熒光發(fā)射光譜（a）和XY的紫外吸收光譜（b）的重疊光譜圖Fig. 5 Overlapped fl uorescence spectra of Cs (a) and UV absorption spectra of XY (b)

Cs熒光光譜與XY吸收光譜的重疊圖見圖5。根據(jù)式（7）～（9）計(jì)算出J值為6.170×10－15cm3·L/mol。所以，R0=2.783 nm，r=3.564 nm，E=0.2。r值均小于7 nm，0.5R0＜r＜1.5R0，表明XY與Cs的結(jié)合反應(yīng)是通過(guò)能量轉(zhuǎn)移的可能性很大[25]，且能猝滅Cs中發(fā)色團(tuán)（主要是色氨酸殘基）的熒光。此外，供體與受體之間的距離在2～8 nm范圍內(nèi)，這再次說(shuō)明了該結(jié)合作用屬于靜態(tài)猝滅[26]。

2.6 同步熒光光譜分析

根據(jù)Miller提出的理論，當(dāng)?λ為15 nm和60 nm時(shí)分別僅反映Tyr和Trp的特征熒光光譜[27]。Tyr和Trp的最大發(fā)射波長(zhǎng)容易受其周圍環(huán)境極性的影響，因此常被用來(lái)表征蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

圖6 ?λ為15 nm（a）和60 nm（b）時(shí)XY與Cs相互作用的同步熒光光譜圖Fig. 6 Synchronous fl uorescence spectra of Cs in the presence of XY at?λ = 15 nm (a) and ?λ = 60 nm (b)

從圖6可以看出，隨著XY用量的增加，Cs兩個(gè)不同波長(zhǎng)差的同步熒光光譜均明顯降低，這與He Zhiyong等[3]研究錦葵-3-O-葡萄苷對(duì)牛乳α-Cs和β-Cs同步熒光光譜影響的結(jié)果相似，表明Cs分子中的Tyr和Trp均由于XY的加入而被不同程度的猝滅，但相比之下，Trp的被猝滅程度要大于Tyr，由此可以判斷XY主要結(jié)合在Cs的Trp殘基上；此外，?λ為60 nm的譜圖表現(xiàn)出明顯的藍(lán)移現(xiàn)象，而?λ為15 nm譜圖的出峰位置幾乎沒有變化。因此，當(dāng)XY與Cs結(jié)合后，主要作用于Cs分子中的Trp附近，使Trp周圍微環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，極性減弱，進(jìn)而使Cs分子的結(jié)構(gòu)變得更加緊密[28-29]，與2.1節(jié)得出的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

2.7 三維熒光光譜分析

為進(jìn)一步了解XY對(duì)Cs構(gòu)象的影響，對(duì)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-XY復(fù)合物的三維熒光光譜進(jìn)行測(cè)定。圖7為加入XY前后Cs的三維熒光光譜等高線圖，相應(yīng)的參數(shù)如表3所示。左上角類似“鉛筆型”的峰是瑞利散射峰（λex=λem），右下角的“指紋型”線符合λex小于λem的規(guī)律，是典型的色氨酸和酪氨酸殘基熒光峰的特征[30]。從峰的位置來(lái)看，加入XY后，Cs中瑞利散射峰的起始位置和熒光峰位置均無(wú)明顯變化。從峰的強(qiáng)度來(lái)看，隨著XY濃度的增加，兩種峰都變的稀疏，說(shuō)明加入XY后瑞利散射峰和熒光峰的強(qiáng)度均有不同程度的降低，說(shuō)明色氨酸和酪氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生了變化，進(jìn)而可以推測(cè)XY與Cs間存在相互作用，且二者能夠形成復(fù)合物，并改變Cs的微環(huán)境和構(gòu)象[31]，這與同步熒光的結(jié)果一致。

圖7 Cs和Cs-XY體系的三維熒光等高線圖Fig. 7 Three-dimensional fl uorescence contour map of Cs and Cs-XY systems

表3 Cs與XY相互作用的熒光激發(fā)-發(fā)射矩陣光譜Table 3 Fluorescent EEM spectral characteristics of Cs-XY systems

2.8 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜法是研究小分子與生物大分子之間相互作用時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化的有效方法之一[32]，它具有比紫外吸收光譜和熒光光譜更精細(xì)的信息，能準(zhǔn)確反映出酰胺I帶和酰胺II帶的強(qiáng)度變化和光譜移位，且已經(jīng)成功運(yùn)用于蛋白與多酚的相互作用中[33]。

圖8 Cs和Cs-XY的紅外光譜圖Fig. 8 FTIR spectra of Cs and Cs-XY complex

如圖8所示，Cs和Cs-XY復(fù)合物的出峰位置基本一致，略有移動(dòng)，純Cs的酰胺I帶主要出現(xiàn)在1 635 cm－1處，加入XY之后，Cs的酰胺I帶移動(dòng)到1 632 cm－1處；酰胺II帶從1 538 cm－1移動(dòng)到1 554 cm－1處，說(shuō)明Cs與XY發(fā)生了結(jié)合作用，且這種結(jié)合作用引起了Cs二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，推測(cè)其變化原因可能是XY與Cs肽鏈上的—C＝O—和—C—N—基團(tuán)發(fā)生了結(jié)合作用[34]；此外，Cs的酰胺I帶和酰胺II帶的強(qiáng)度有所降低，說(shuō)明α-螺旋相對(duì)含量在加入XY后明顯減少。這與Kanakis等[35]研究白藜蘆醇、染料木黃酮和姜黃素對(duì)牛乳α-Cs和β-Cs二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果一致。

2.9 圓二色譜分析

圖9 Cs和Cs-XY的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖Fig. 9 Circular dichroism spectra in the far-UV region of Cs and Cs-XY systems

圓二色譜法常被用來(lái)定量測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。它的測(cè)定范圍分為遠(yuǎn)紫外區(qū)（170～250 nm）和近紫外區(qū)（250～300 nm），遠(yuǎn)紫外區(qū)能夠顯示主鏈的構(gòu)象變化[36]。Cs與XY體系的圓二色譜圖見圖9，利用SELCON3程序?qū)s和Cs-XY中二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化的計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 Cs和Cs-XY二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 4 Secondary structure composition of Cs and Cs-XY systems%

從圖9可以看出，純Cs在220～230 nm間有兩個(gè)明顯的負(fù)峰，這是蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征；在加入XY之后，隨著XY濃度的增加，Cs的兩個(gè)負(fù)峰呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，表明Cs的結(jié)構(gòu)從無(wú)序轉(zhuǎn)變?yōu)橛行颉＿@與畢紅娜[37]用圓二色譜的方法研究鹽酸四環(huán)素與3 種牛乳蛋白相互作用時(shí)結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果相同。如表4所示，游離Cs的α-螺旋相對(duì)含量為54.91%，當(dāng)加入XY后，α-螺旋相對(duì)含量在不斷減少，其可能部分轉(zhuǎn)變成了β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。這些圓二色譜結(jié)果證明了Cs與XY的相互作用導(dǎo)致Cs二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，與傅里葉變換紅外光譜得出的結(jié)果相一致。

2.10 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

圖10 不同濃度XY對(duì)Cs乳化活性（a）和乳化穩(wěn)定性（b）的影響Fig. 10 Effect of XY concentration on emulsification activity (a) and emulsion stability (b) of Cs

從圖10a可以看出，隨著所加入XY濃度的增加，Cs的乳化活力指數(shù)逐漸降低，乳化穩(wěn)定性逐漸升高。結(jié)構(gòu)決定功能，由2.9節(jié)結(jié)果可知，在XY的作用下，Cs的α-螺旋相對(duì)含量減少，使其二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加致密、有序，分子的柔順性降低，進(jìn)而導(dǎo)致Cs的乳化活力指數(shù)降低[38]。乳化穩(wěn)定性逐漸升高，表明XY使Cs乳化液的穩(wěn)定性增加。這可能是由于XY的添加，增加了Cs乳化液的表觀黏度，使乳化液微粒間的碰撞頻率減少，從而提高了蛋白質(zhì)乳化液的穩(wěn)定性。這與Pan Mingzhe等[8]的研究結(jié)果一致。

2.11 表面疏水性分析

圖11 不同濃度XY對(duì)Cs表面疏水性的影響Fig. 11 Effect of XY concentration on surface hydrophobicity of Cs

如圖11所示，隨著XY濃度的增加，Cs表面疏水性整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)Cs與XY濃度比為1∶10時(shí)，Cs的表面疏水性從252降低到127，可能是由于XY與Cs在水溶液中能直接形成氫鍵，使Cs分子周圍形成親水層，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的水化作用，從而降低蛋白質(zhì)的表面疏水性[39]。還有可能是因?yàn)槎嘣伎梢赃M(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部誘導(dǎo)疏水表面區(qū)域的重新排列，從而抑制疏水探針與蛋白的結(jié)合。這也為Cs的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得致密，有序提供了有利的證據(jù)。同時(shí)也表明Cs的三級(jí)結(jié)構(gòu)可能也發(fā)生了變化。

3 結(jié) 論

通過(guò)利用熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜、傅里葉紅外光譜和圓二色譜的多光譜組合法探究XY對(duì)Cs光譜性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)的影響，并測(cè)定了其乳化性和表面疏水性的變化，有助于更好地理解牛乳蛋白質(zhì)和XY之間的結(jié)合過(guò)程中涉及的化學(xué)機(jī)理，為功能性乳基料的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。具體得出以下結(jié)論：1）XY對(duì)Cs的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅，生成了Cs-XY復(fù)合物，結(jié)合常數(shù)較大，且隨著溫度的升高而降低，說(shuō)明生成的復(fù)合物不穩(wěn)定。二者至少存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合距離為3.56 nm，結(jié)合過(guò)程是一個(gè)自發(fā)的放熱反應(yīng)，主要作用力是靜電引力和疏水作用力。2）XY的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸，使色氨酸周圍的微環(huán)境變得更加疏水，從而引起Cs的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變化，進(jìn)一步說(shuō)明Cs與XY發(fā)生了相互作用。3）傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜的結(jié)果表明，與XY相互作用后，Cs的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量從54.91%降至44.97%，其他組分的相對(duì)含量略有增加，結(jié)構(gòu)更趨向于緊密狀態(tài)，證明XY的存在確實(shí)會(huì)影響Cs的二級(jí)結(jié)構(gòu)。4）在XY的作用下，隨著XY濃度的增加，Cs的乳化活性降低，乳化穩(wěn)定性增加，表面疏水性降低，證實(shí)了Cs的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。