基于多重光譜技術的木糖醇與牛乳酪蛋白相互作用及對酪蛋白結構的影響

孔繁華，曹雪妍，康世墨，李瑋軒，關博元，李墨翰，楊 梅，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳酪蛋白（casein，Cs）具有豐富的營養價值，且由于其疏水性低、凈電荷高，在天然條件下及加工過程中均呈現出獨特的展開結構[1-2]，引起了人們研究它與花色苷、多酚、藥物等物質相互作用的極大興趣，并且有研究發現它們之間的相互作用會影響Cs的結構和功能性質。例如，He Zhiyong等[3]報道α-Cs和β-Cs分別通過親水（范德華力或氫鍵）和疏水相互作用與麥芽糖-3-O-葡萄糖苷結合，并且對其熱穩定性、氧化穩定性和光穩定性有積極作用；Bi Hongna等[4]研究發現鹽酸四環素對牛乳β-Cs、α-乳白蛋白的猝滅機制是靜態猝滅，分別通過靜電引力和氫鍵而發生結合相互作用，使兩種蛋白質的二級結構發生了顯著變化，且表面疏水性也有所降低。Haratifar等[5]發現茶多酚與Cs相互作用形成的復合物能夠影響凝乳酶誘導的牛奶凝膠化，且影響是有濃度依賴性的。

木糖醇（xylitol，XY）是一種天然的多元醇，是良好的助溶劑，具有類似蔗糖的甜味能力，常見于水果和蔬菜中，在體內消化時，能做到不引起胰島素含量上升，不給糖尿病患者的代謝增加負擔，還常被用作為營養補充劑，在醫藥工業和食品工業中都起著至關重要的作用[6-7]。目前已經有大量研究表明XY等糖醇化合物能夠改善球狀蛋白質的功能特性，例如熱穩定性、膠凝性、起泡特性以及乳化穩定性等，并且對它們起到穩定和保護的作用。Pan Mingzhe等[8]研究發現XY等助溶劑能使大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的二級結構變得更加有序，而結構的變化導致SPI的發泡性和表面疏水性降低，溶解性增加；Kommineni等[9]研究了XY對低脂工藝奶酪功能特性的影響，發現加入XY后，低脂工藝奶酪的硬度顯著降低，流變性能等功能性質有所提高。但相關研究尚未涉及XY與Cs的相互作用以及對蛋白質結構和功能特性的影響，因此明確XY與Cs的相互作用不僅可以顯著提高XY的生物利用率，還有可能改善Cs的功能性質。

本研究旨在利用多重光譜相結合的技術研究XY與Cs的相互作用機制以及對Cs結構和功能特性的影響。擬采用熒光猝滅法研究XY對Cs的猝滅機制，判斷二者之間是否存在相互作用，并計算二者的結合常數、結合位點、結合距離以及相關的熱力學參數，探討二者的相互作用機制；利用同步熒光光譜法研究XY主要結合的氨基酸殘基；利用三維熒光光譜法研究XY對Cs中氨基酸殘基微環境極性的影響，進而推測對Cs構象的影響；采用傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜法分析評價Cs二級結構及相對含量的變化，進一步驗證XY與Cs相互作用的存在，此外還對復合物的乳化性和表面疏水性進行測定，從而為XY在乳制品中的添加及功能性乳基料的開發提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆色拉油 益海嘉里食品營銷有限公司。C s（蛋白質含量≥9 5.0%，相對分子質量為50 000～37 5000）、XY（純度＞99%，相對分子質量為152.1） 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4），NaOH、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團化學試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）美國Sigma公司；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

F-4600熒光光譜儀 日本日立公司；FT-IR200傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；RH basic2磁力攪拌器 廣州科儀實驗室技術有限公司；Cary 50紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；J-810圓二色譜儀日本Jasco公司；MP2002電子天平 上海舜宇科學儀器有限公司；冷凍真空干燥機 撫順康源保鮮技術發展公司；DK-S26數顯電子恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-25型數顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；T18 basic高速分散器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

參考趙煥焦等[10]的方法配制1 mg/mL的Cs儲備液；參考Chen Haiying等的方法[11]，略有改動，配制XY溶液：稱取適量XY固體，溶于0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，置于磁力攪拌器上攪拌30 min（確保充分溶解），定容，配制成0.1 mol/L的XY原溶液，再用Tris-HCl溶液將其稀釋到1×10－5mol/L，備用。Cs溶液和XY溶液均現配現用。

1.3.2 內源熒光光譜測定

取1 mL 1 mg/mL的Cs溶液和適量1×10－5mol/L的XY溶液于試管中，使最終Cs與XY濃度比為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，每次加入25 μL XY溶液，充分振蕩混合均勻，分別置于300、310 K和320 K的水浴鍋中加熱恒溫30 min，激發波長選擇280 nm，狹縫均為5 nm，掃描300～450 nm的發射光譜。分別在波長差Δλ為15 nm和60 nm條件下，掃描樣品在220～350 nm范圍內的同步熒光光譜。

三維熒光光譜在以下條件下進行：初始激發波長為200 nm，增量為5 nm，發射波長在200～450 nm之間，激發和發射狹縫寬度分別為5 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將Cs和Cs與XY濃度比為1∶4的樣品溶液置于超低溫冰箱中預冷凍3～4 h，再置于冷凍真空干燥機中干燥24 h，獲得樣品粉末，將凍干樣品與KBr按照質量比為1∶100混合，研磨均勻，置于模具中壓片，以KBr作為背景，對樣品的全波段（4 000～400 cm－1）進行掃描，分辨率為4 cm－1，掃描次數為32 次。使用Omnic軟件進行數據分析，然后用Origin作圖。

1.3.4 圓二色譜分析

用Jasco-815圓二色譜儀在25 ℃條件下測定樣品在遠紫外區域（190～250 nm）的圓二色譜，以0.1 mol/L NaOH和0.05 mol/L Tris-HCl混合液為空白緩沖液，將緩沖溶液加入比色皿中，比色皿光徑為0.1 cm，測定遠紫外區的圓二色譜。掃描速率100 nm/min，數據間隔1.0 nm，帶寬2.0 nm，掃描3 次，取平均值得到最終的圓二色譜。

1.3.5 乳化性測定

取9 mL蛋白質質量濃度為1 mg/mL的復合物溶液與3 mL大豆油混合，10 000 r/min高速分散處理1 min形成均一的乳狀液，分別在0 min和10 min，用微量注射器從底部取50 μL液體，用0.1% SDS溶液（pH 7）稀釋100 倍，將上述的溶液充分混合均勻，均勻后測定樣品在500 nm波長處的吸光度，以SDS溶液為空白。乳化活力指數和乳化穩定指數計算公式如下：

式中：EAI為乳化活力指數/（m2/g）；ESI為乳化穩定指數/min；DF為稀釋因子，100；C為蛋白質質量濃度/（g/mL）；φ為比色皿光徑（1 cm）；θ為油相體積分數（0.25）；A0、A10分別為0 min和10 min時的吸光度。

1.3.6 表面疏水性測定

采用熒光探針法，用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液將樣品稀釋成不同濃度的溶液，使溶液中蛋白質質量濃度在0.01～0.1 mg/mL之間。取不同質量濃度的稀釋樣品5 mL，加入25 μL的ANS溶液（用pH 7.4、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制成8 mmol/L的溶液），振蕩混合均勻，并于室溫下暗反應處理5 min。在激發波長390 nm、發射波長470 nm、激發和發射狹縫寬均為5 nm條件下，測定樣品的熒光強度。以熒光強度對蛋白質質量濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.4 數據統計與分析

每組數據均重復做3 次，采用Origin 9.0軟件和Excel作圖，用SPASS 7.8軟件進行誤差分析。

2 結果與分析

2.1 內源性熒光光譜分析

圖1 XY的熒光光譜圖Fig. 1 fl uorescence spectrum of XY

圖2 Cs與XY相互作用的熒光猝滅圖（T=300 K）Fig. 2 Fluorescence quenching of the interaction between XY andCs(T = 300 K)

圖1 為同一條件下獲得的XY的發射光譜，圖中有兩個吸收峰，一個位于311 nm附近，一個位于362 nm附近，熒光強度都較弱，可以忽略不計，故不會對Cs的熒光發射光譜產生影響。

Cs自身含有3 種生色基團——色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。當在280 nm波長激發時，普通具有熒光的蛋白質分別在348、303、282 nm波長處出現吸收峰，強度比約為Trp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5[12-13]。如圖2所示，純Cs溶液（曲線1）的最大發射波長（λmax）約在350 nm處，可以判斷促使Cs發熒光的主要是Trp殘基。

由圖2還可以看出，隨著XY濃度的不斷增加，Cs的熒光強度（F）不斷降低，當Cs與XY的濃度比從1∶0達到1∶10時，F從1 974減少至382，XY對Cs的內源熒光產生了熒光猝滅作用，表明XY可能與Cs發生了相互作用。此外還發現，Cs的λmax從350 nm藍移到340 nm，可能是由于Cs中的Trp和Tyr是具有相對較強疏水性的氨基酸殘基，其熒光光譜對于周圍微環境的變化比較敏感，有研究表明，熒光物質的發射光譜藍移表明Trp殘基附近的微環境發生改變，紅移則對應Tyr殘基附近微環境的改變[14]。因此可以說明Cs與XY發生了相互作用，使Cs中Trp殘基附近的極性降低，使其處于更疏水的環境中[15]。類似研究結果如楊國平等[16]經過研究表明XY能通過與人血清白蛋白的相互作用而對其產生熒光猝滅效應。

2.2 XY與Cs的猝滅效應

蛋白質發生熒光猝滅的機理有兩種，動態猝滅和靜態猝滅。為區分猝滅機理，進行了溫度實驗。通常用Stern-Volmer曲線方程描述[17]：

式中：F0為Cs的熒光強度；F為加入XY后Cs的熒光強度；Ksv為Stern-Volmer動態猝滅常數/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數/（L/（mol·s））；CQ為XY濃度/（mol/L）；τ0為XY不存在時Cs的平均熒光壽命/（10－8s）。

圖3 300、310 K和320 K時XY對Cs熒光猝滅的Stern-Volmer方程Fig. 3 Stern-Volmer curves of fl uorescence quenching of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表1 不同溫度下XY與Cs的Stern-Volmer猝滅常數Ksv和雙分子猝滅過程的速率常數KqTable 1 Stern-Volmer quenching constants and bimolecular quenching constants of XY with Cs at three temperatures

根據式（3）用F0/F對CQ作圖，可以得到Cs與XY相互作用的Stern-Volmer曲線，如圖3所示，根據圖中的直線斜率可以計算出公式中的Ksv和Kq，結果見表1。F0/F與CQ呈現出良好的線性關系，說明在反應過程中只存在一種猝滅機制。根據動態猝滅和靜態猝滅對于溫度偏好的不同[18]以及結合表1結果發現，3 個溫度下的Ksv值隨著溫度的升高而變小，符合靜態猝滅的規律。而且XY對Cs猝滅的速率常數Kq大于生物大分子的最大動態猝滅速率常數2.0×1010L/（mol·s），因此，可以判斷XY對Cs內在熒光猝滅效應的機制主要是通過與Cs形成新的復合物的靜態猝滅[3]。表1中的相關系數均在0.99以上，說明XY與Cs相互作用的Stern-Volmer曲線方程給出的結合模式是可靠的。張青等[19]研究左氟沙星與Cs的相互作用時也得出了相同的結論。

2.3 結合常數（KA）及結合位點數（n）的計算

對于靜態猝滅過程，遵循下列公式[20]：

式中：F0、F、CQ同式（3），KA為結合常數；n為結合位點數。以lg[（F0－F）/F]對lgCQ作圖（根據式（4）），可以得到XY與Cs相互作用的雙對數回歸曲線（圖4）。

圖4 不同溫度下XY與Cs相互作用的雙對數回歸曲線Fig. 4 Linear plot of lg [(F0?F)/F] versus lgCQ of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

表2 不同溫度下XY與Cs的結合常數KA、結合位點數n及熱力學參數Table 2 Binding constants and thermodynamic parameters of Cs with XY at 300, 310 and 320 K

根據圖4中直線的斜率和截距可以計算出XY與Cs相互作用的結合位點數n和結合常數KA，結果見表2。可以看出，XY與Cs之間至少存在一個結合位點。結合常數KA較大，數量級在106左右，隨著溫度的升高，KA逐漸降低，表明在結合過程中生成的復合物Cs-XY不穩定，當溫度升高時，復合物可能部分分解。KA和n的值都隨著溫度的升高而下降，與2.2節中Ksv的趨勢一致，再次證明該過程的猝滅機制屬于靜態猝滅。Zhang Yezhong等[21]利用熒光光譜研究牛血清白蛋白與對氨基偶氮苯的相互作用時也發現二者的結合常數KA隨著溫度的升高而逐漸變小，猝滅機制屬于生成了不穩定復合物的靜態猝滅。

2.4 熱力學參數與作用力

小分子和蛋白質等大分子之間的相互作用主要涉及4種結合力：疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。如果溫度變化范圍不太寬，可以將相互作用中的ΔH視為常數。根據Van’t Hoff方程（式（5））和熱力學關系（式（6））[22]計算?G、?H和?S：

式中：KA為溫度T條件下的結合常數，R為氣體常數（8.314 J/（mol·K））。

根據公式（5）以lnKA對1/T作圖，由直線的斜率和截距能分別求出熱力學參數焓變（?H）和熵變（?S），代入式（6）可以求得?G，結果見表2。從表2可以看出，XY與Cs相互作用的過程中?G＜0，表明該結合過程是自發進行的；?H＜0，?S＞0，說明Cs與XY之間的相互作用屬于放熱反應，反應中的主要作用力為靜電引力[23]，但是考慮?S＞0，所以也不排除疏水性相互作用在其中起作用[13]。An Xin等[17]對硫鳥嘌呤與人血清白蛋白相互作用進行了研究，發現二者之間的結合類型也屬于自發的放熱反應。

2.5 結合距離

根據福斯特能量轉移理論[24]，能量轉移效率E由式（7）給出：

式中：r為供體-受體間的距離/nm；R0為轉移效率為50%時的臨界距離/nm。

式中：K2為與偶極子給體-受體的幾何形狀相關的取向因子，液體溶液中通常取2/3；n為介質的折射率（1.336）；Φ為供體的熒光量子產額，取值為0.4；J為供體發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。這里的供體和受體分別為Cs和XY。J由式（9）給出：

式中：F（λ）為Cs在λ波長處的熒光強度；ε（λ）為XY在λ波長處的摩爾吸光系數。從這些關系中，可以計算出J、R0和E，因此也可以計算出r的值。

圖5 Cs的熒光發射光譜（a）和XY的紫外吸收光譜（b）的重疊光譜圖Fig. 5 Overlapped fl uorescence spectra of Cs (a) and UV absorption spectra of XY (b)

Cs熒光光譜與XY吸收光譜的重疊圖見圖5。根據式（7）～（9）計算出J值為6.170×10－15cm3·L/mol。所以，R0=2.783 nm，r=3.564 nm，E=0.2。r值均小于7 nm，0.5R0＜r＜1.5R0，表明XY與Cs的結合反應是通過能量轉移的可能性很大[25]，且能猝滅Cs中發色團（主要是色氨酸殘基）的熒光。此外，供體與受體之間的距離在2～8 nm范圍內，這再次說明了該結合作用屬于靜態猝滅[26]。

2.6 同步熒光光譜分析

根據Miller提出的理論，當?λ為15 nm和60 nm時分別僅反映Tyr和Trp的特征熒光光譜[27]。Tyr和Trp的最大發射波長容易受其周圍環境極性的影響，因此常被用來表征蛋白質構象的變化。

圖6 ?λ為15 nm（a）和60 nm（b）時XY與Cs相互作用的同步熒光光譜圖Fig. 6 Synchronous fl uorescence spectra of Cs in the presence of XY at?λ = 15 nm (a) and ?λ = 60 nm (b)

從圖6可以看出，隨著XY用量的增加，Cs兩個不同波長差的同步熒光光譜均明顯降低，這與He Zhiyong等[3]研究錦葵-3-O-葡萄苷對牛乳α-Cs和β-Cs同步熒光光譜影響的結果相似，表明Cs分子中的Tyr和Trp均由于XY的加入而被不同程度的猝滅，但相比之下，Trp的被猝滅程度要大于Tyr，由此可以判斷XY主要結合在Cs的Trp殘基上；此外，?λ為60 nm的譜圖表現出明顯的藍移現象，而?λ為15 nm譜圖的出峰位置幾乎沒有變化。因此，當XY與Cs結合后，主要作用于Cs分子中的Trp附近，使Trp周圍微環境的疏水性增強，極性減弱，進而使Cs分子的結構變得更加緊密[28-29]，與2.1節得出的結果相對應。

2.7 三維熒光光譜分析

為進一步了解XY對Cs構象的影響，對蛋白質和蛋白質-XY復合物的三維熒光光譜進行測定。圖7為加入XY前后Cs的三維熒光光譜等高線圖，相應的參數如表3所示。左上角類似“鉛筆型”的峰是瑞利散射峰（λex=λem），右下角的“指紋型”線符合λex小于λem的規律，是典型的色氨酸和酪氨酸殘基熒光峰的特征[30]。從峰的位置來看，加入XY后，Cs中瑞利散射峰的起始位置和熒光峰位置均無明顯變化。從峰的強度來看，隨著XY濃度的增加，兩種峰都變的稀疏，說明加入XY后瑞利散射峰和熒光峰的強度均有不同程度的降低，說明色氨酸和酪氨酸殘基附近的微環境發生了變化，進而可以推測XY與Cs間存在相互作用，且二者能夠形成復合物，并改變Cs的微環境和構象[31]，這與同步熒光的結果一致。

圖7 Cs和Cs-XY體系的三維熒光等高線圖Fig. 7 Three-dimensional fl uorescence contour map of Cs and Cs-XY systems

表3 Cs與XY相互作用的熒光激發-發射矩陣光譜Table 3 Fluorescent EEM spectral characteristics of Cs-XY systems

2.8 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜法是研究小分子與生物大分子之間相互作用時二級結構的變化的有效方法之一[32]，它具有比紫外吸收光譜和熒光光譜更精細的信息，能準確反映出酰胺I帶和酰胺II帶的強度變化和光譜移位，且已經成功運用于蛋白與多酚的相互作用中[33]。

圖8 Cs和Cs-XY的紅外光譜圖Fig. 8 FTIR spectra of Cs and Cs-XY complex

如圖8所示，Cs和Cs-XY復合物的出峰位置基本一致，略有移動，純Cs的酰胺I帶主要出現在1 635 cm－1處，加入XY之后，Cs的酰胺I帶移動到1 632 cm－1處；酰胺II帶從1 538 cm－1移動到1 554 cm－1處，說明Cs與XY發生了結合作用，且這種結合作用引起了Cs二級結構的改變，推測其變化原因可能是XY與Cs肽鏈上的—C＝O—和—C—N—基團發生了結合作用[34]；此外，Cs的酰胺I帶和酰胺II帶的強度有所降低，說明α-螺旋相對含量在加入XY后明顯減少。這與Kanakis等[35]研究白藜蘆醇、染料木黃酮和姜黃素對牛乳α-Cs和β-Cs二級結構影響的結果一致。

2.9 圓二色譜分析

圖9 Cs和Cs-XY的遠紫外圓二色譜圖Fig. 9 Circular dichroism spectra in the far-UV region of Cs and Cs-XY systems

圓二色譜法常被用來定量測定蛋白質二級結構的相對含量。它的測定范圍分為遠紫外區（170～250 nm）和近紫外區（250～300 nm），遠紫外區能夠顯示主鏈的構象變化[36]。Cs與XY體系的圓二色譜圖見圖9，利用SELCON3程序對Cs和Cs-XY中二級結構相對含量變化的計算結果見表4。

表4 Cs和Cs-XY二級結構的相對含量Table 4 Secondary structure composition of Cs and Cs-XY systems%

從圖9可以看出，純Cs在220～230 nm間有兩個明顯的負峰，這是蛋白質中α-螺旋結構的典型特征；在加入XY之后，隨著XY濃度的增加，Cs的兩個負峰呈現上升的趨勢，表明Cs的結構從無序轉變為有序。這與畢紅娜[37]用圓二色譜的方法研究鹽酸四環素與3 種牛乳蛋白相互作用時結構變化的結果相同。如表4所示，游離Cs的α-螺旋相對含量為54.91%，當加入XY后，α-螺旋相對含量在不斷減少，其可能部分轉變成了β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構。這些圓二色譜結果證明了Cs與XY的相互作用導致Cs二級結構的變化，與傅里葉變換紅外光譜得出的結果相一致。

2.10 乳化活性和乳化穩定性分析

圖10 不同濃度XY對Cs乳化活性（a）和乳化穩定性（b）的影響Fig. 10 Effect of XY concentration on emulsification activity (a) and emulsion stability (b) of Cs

從圖10a可以看出，隨著所加入XY濃度的增加，Cs的乳化活力指數逐漸降低，乳化穩定性逐漸升高。結構決定功能，由2.9節結果可知，在XY的作用下，Cs的α-螺旋相對含量減少，使其二級結構變得更加致密、有序，分子的柔順性降低，進而導致Cs的乳化活力指數降低[38]。乳化穩定性逐漸升高，表明XY使Cs乳化液的穩定性增加。這可能是由于XY的添加，增加了Cs乳化液的表觀黏度，使乳化液微粒間的碰撞頻率減少，從而提高了蛋白質乳化液的穩定性。這與Pan Mingzhe等[8]的研究結果一致。

2.11 表面疏水性分析

圖11 不同濃度XY對Cs表面疏水性的影響Fig. 11 Effect of XY concentration on surface hydrophobicity of Cs

如圖11所示，隨著XY濃度的增加，Cs表面疏水性整體呈現下降的趨勢，當Cs與XY濃度比為1∶10時，Cs的表面疏水性從252降低到127，可能是由于XY與Cs在水溶液中能直接形成氫鍵，使Cs分子周圍形成親水層，增強了蛋白質的水化作用，從而降低蛋白質的表面疏水性[39]。還有可能是因為多元醇可以進入蛋白質內部誘導疏水表面區域的重新排列，從而抑制疏水探針與蛋白的結合。這也為Cs的二級結構變得致密，有序提供了有利的證據。同時也表明Cs的三級結構可能也發生了變化。

3 結 論

通過利用熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜、傅里葉紅外光譜和圓二色譜的多光譜組合法探究XY對Cs光譜性質以及結構的影響，并測定了其乳化性和表面疏水性的變化，有助于更好地理解牛乳蛋白質和XY之間的結合過程中涉及的化學機理，為功能性乳基料的生產提供理論依據。具體得出以下結論：1）XY對Cs的熒光猝滅機制是靜態猝滅，生成了Cs-XY復合物，結合常數較大，且隨著溫度的升高而降低，說明生成的復合物不穩定。二者至少存在一個結合位點，結合距離為3.56 nm，結合過程是一個自發的放熱反應，主要作用力是靜電引力和疏水作用力。2）XY的結合位點更接近于色氨酸，使色氨酸周圍的微環境變得更加疏水，從而引起Cs的結構發生部分變化，進一步說明Cs與XY發生了相互作用。3）傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜的結果表明，與XY相互作用后，Cs的α-螺旋結構相對含量從54.91%降至44.97%，其他組分的相對含量略有增加，結構更趨向于緊密狀態，證明XY的存在確實會影響Cs的二級結構。4）在XY的作用下，隨著XY濃度的增加，Cs的乳化活性降低，乳化穩定性增加，表面疏水性降低，證實了Cs的結構發生了變化。