榛仁降脂活性肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

周美含，郭 勇，魏 貞，趙 蘭，秦漢雄，王 輯，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

我國榛子資源豐富，廣泛分布在吉林長白山地區(qū)，且以榛屬植物中唯一得到人工利用的平歐大果榛子（Corylus heterophylla × avellana）最為知名。榛子果仁具有很好的食用和藥用價值，是國際公認的四大堅果之一，其營養(yǎng)豐富，總蛋白質(zhì)量分數(shù)占20%左右，富含8 種人體必需氨基酸[1-3]。目前國內(nèi)有關(guān)榛仁的研究還主要集中在對其果仁蛋白活性肽的分離純化、制備及生物活性驗證等方面的研究，如調(diào)節(jié)免疫[4]、降血壓[5-6]、抑菌[7]、抗氧化[8]等。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，尤其是對各種高脂高糖食物的攝入量不斷增長，導(dǎo)致脂代謝異常，從而引發(fā)肥胖、動脈粥樣硬化、心血管疾病和癌癥等疾病逐年上升，嚴重危害人類健康[9-11]。目前常見的減肥降脂藥有樹脂類、貝特類、煙酸類、他汀類、安非他命類似物等。然而，這些藥物長期服用可能會引起惡心、腹瀉、嘔吐、低血糖等多種不良生理反應(yīng)[12-13]。因此探尋一種天然的、安全有效的藥食同源類降脂產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實意義。目前研究已發(fā)現(xiàn)的具有降脂作用的功能性食品成分有膳食纖維、多糖、多酚、生物堿、皂苷、生物活性肽等物質(zhì)[14]。近年來，國內(nèi)外很多學者已從食品中得到具有降脂活性的多肽。Choi等[15]從大豆中分離鑒定出六肽VAWWMY，通過動物實驗證明其能改善小鼠血脂異常，且發(fā)現(xiàn)其活性位點為疏水氨基酸Trp和Try。Zhang Huijuan等[16]發(fā)現(xiàn)從大豆中得到的疏水性肽LPYPR和WGAPSL可以通過上調(diào)CYP51、LDLR、CYP7A1和LPL的mRNA水平而降低血脂。Mudgil等[17]研究發(fā)現(xiàn)從駱駝乳蛋白水解產(chǎn)物得到的多肽FCLPLPLLK和KFQWGY可顯著結(jié)合豬胰脂肪酶的Ser153、Phe216和His264等位點，從而實現(xiàn)降低胰脂肪酶活性。因此從食物中獲得具有降血脂的成分，尤其是從食物蛋白中獲得具有降血脂活性多肽的研究具有較好發(fā)展前景。

本課題組在前期工作中，以水解度和胰脂肪酶抑制率為指標，通過單因素及響應(yīng)面試驗對長白山野生榛仁分離蛋白堿性蛋白酶酶解工藝進行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，本實驗主要以榛仁分離蛋白酶解液為原料，通過超濾、凝膠層析（Sephadex G-25、Sephadex G-15）及反相高效液相色譜進行分離純化，然后通過飛行質(zhì)譜對獲得的高活性純化多肽組分進行結(jié)構(gòu)鑒定，最后對合成的氨基酸肽段進行降脂活性驗證，本實驗可為長白山野生榛子資源的深度開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榛仁分離蛋白由實驗室自制。

3T3-L1前脂肪細胞 美國ATCC細胞庫；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；胰脂肪酶、對硝基苯酚酯棕櫚酸酯、?；悄懰徕c、膽固醇、油酸、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazd-2-yl)-2,5-diphenylentrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、Sephadex G-25、Sephadex G-15、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松 美國Sigma公司；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測試試劑盒、油紅O染液試劑盒 南京建成生物科技有限公司；胎牛血清、新生牛血清 美國Gibco公司；合成肽FLLPH 北京中科亞光生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RSA224S型分析天平 北京賽多利斯科學（北京）儀器有限公司；ZY-1000切向流動超濾系統(tǒng)、HD-3型紫外檢測器、BSZ-100型自動部分收集、HL-2型恒流泵 上海紫玉生物科技有限公司；1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；CB150型CO2培養(yǎng)箱 德國Binder公司；AE31倒置顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榛仁分離蛋白的酶解

利用Alcalase 2.4L堿性蛋白酶酶解榛仁分離蛋白，結(jié)合單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化酶解工藝條件，制備具有降脂活性的水解產(chǎn)物。根據(jù)前期實驗得到酶解最優(yōu)條件為底物質(zhì)量濃度2 g/100 mL、酶解時間120 min、酶解溫度54 ℃、酶解pH 9.3、加酶量10 422 U/g（以底物質(zhì)量計）。將酶解液在沸水浴中滅酶10 min，以備后續(xù)實驗。

1.3.2 降脂活性化學方法驗證

胰脂肪酶抑制率的測定：參照文獻[18]；膽固醇膠束測定：參照文獻[19]；膽固醇含量的測定：參照文獻[20]。

1.3.3 降脂活性的細胞檢測

1.3.3.1 不同組分對小鼠3T3-L1前脂肪細胞的毒性

將3T3-L1前脂肪細胞調(diào)整密度為105個/100 μL接種到96 孔板，每孔體積100 μL，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，以不含樣品的培養(yǎng)液為空白組，以含不同質(zhì)量濃度樣品的培養(yǎng)液為實驗組，刺激48 h，加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。酶標儀測定OD490nm值[21]。

1.3.3.2 細胞分化實驗

采用經(jīng)典“雞尾酒誘導(dǎo)法”，根據(jù)文獻[22]方法，在誘導(dǎo)分化過程中，以未誘導(dǎo)分化的細胞為對照組，不含樣品組分的分化組為模型組，含不同質(zhì)量濃度樣品組分的分化組為實驗組。將細胞接種到24 孔板中，接種量為2×104個/孔經(jīng)過8 d誘導(dǎo)分化至3T3-L1前細胞為成熟的脂肪細胞。

細胞內(nèi)脂質(zhì)含量：根據(jù)油紅O試劑盒說明書的方法將成熟的脂肪細胞染色，每孔加入500 μL異丙醇，將細胞內(nèi)的染料溶解到異丙醇中，取200 μL到96 孔板中，用酶標儀測OD520nm[23]；細胞內(nèi)甘油三酯含量：根據(jù)甘油三酯試劑盒說明說操作；細胞內(nèi)總膽固醇含量：根據(jù)總膽固醇試劑盒說明說操作。

1.3.4 榛仁降脂肽的分離純化

1.3.4.1 超濾分離

分別利用分子質(zhì)量為10 kDa和3 kDa的超濾膜盒依次對酶解液（已滅酶）進行分離，得到3 個不同分子質(zhì)量的組分：A1（＞10 kDa）、A2（3～10 kDa）和A3（＜3 kDa）。分別收集3 個組分，經(jīng)冷凍干燥后測定胰脂肪酶抑制率、膽固醇膠束結(jié)合率、成熟脂肪細胞中脂質(zhì)含量、總膽固醇含量及甘油三酯含量。

1.3.4.2 凝膠滲透層析分離純化

將超濾后的榛仁分離蛋白降脂活性肽配制成40 mg/mL溶液，過0.45 μm濾膜，進行Sephadex G-25分離，以蒸餾水為流動相，流速1 mL/min，上樣量3 mL，紫外檢測波長280 nm。將各組分收集、濃縮、凍干，并測定各組分的胰脂肪酶抑制率、膽固醇膠束結(jié)合率、成熟脂肪細胞中脂質(zhì)含量、總膽固醇含量及甘油三酯含量。

將經(jīng)過Sephadex G-25分離得到的降脂活性效果最佳的組分配制成40 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜，進行Sephadex G-15的進一步分離純化。以蒸餾水為流動相，流速0.8 mL/min，上樣量3 mL，在280 nm波長處進行檢驗，將各組分收集、濃縮、凍干并測定其胰脂肪酶抑制率、膽固醇膠束結(jié)合率、成熟脂肪細胞中脂質(zhì)含量、總膽固醇含量及甘油三酯含量。

1.3.4.3 反相高效液相色譜分析

取經(jīng)凝膠滲透層析分離純化后降脂活性效果最佳的凍干組分，配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL溶液，過0.22 μm濾膜，使用ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檢測波長220 nm，柱溫20 ℃；流速0.5 mL/min；上樣量30 μL；流動相A為水（含0.1%的三氟乙酸）；B為乙腈（含0.1%的三氟乙酸）。梯度洗脫條件：0～30 min，95% A（線性梯度）；30～40 min，78% A（線性梯度）；40～60 min，95% A（線性梯度）[24]。根據(jù)圖譜的峰收集組分，驗證為單一峰，冷凍干燥。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜分析參考文獻[25]方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離各組分降脂結(jié)果

圖1 超濾各組分的降脂活性結(jié)果Fig. 1 Hypolipidemic effects of ultrafiltration fractions

榛仁分離蛋白酶解液經(jīng)超濾后得到3 個分子質(zhì)量不同的組分：A1（＞10 kDa）、A2（3～10 kDa）和A3（＜3 kDa）。從圖1a可知，A3組分對胰脂肪酶抑制率（35.9%）和膽固醇膠束吸附率（58.9%）均顯著（P＜0.05）高于其他2 個組分。由圖1b可知，各組分在質(zhì)量濃度低于80 mg/L時對細胞生長無明顯影響，而高于此濃度時各組分會對細胞的生長產(chǎn)生抑制作用，因此選擇80 mg/L的質(zhì)量濃度進行細胞實驗。從圖1c和圖1d可知，與對照組相比，模型組和實驗組的脂質(zhì)含量均極顯著（P＜0.01）增加，表明經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后模型組的細胞成功的分化為成熟的脂肪細胞，經(jīng)多肽處理后的細胞雖然也可分化成為成熟的脂肪細胞，但與模型組相比其分化程度受到抑制，且A3能顯著（P＜0.05）抑制脂質(zhì)的積累，降低總膽固醇（17.64%）和甘油三酯（16.72%）含量，可較好地抑制脂肪細胞分化。因此，選擇A3組分進一步分離純化。

2.2 榛仁分離蛋白降脂肽的Sephadex G-25分離純化

圖2 組分A3的Sephadex G-25分離譜圖Fig. 2 Chromatogram of fraction A3 separated on Sephadex G-25

圖3 Sephadex G-25分離純化A3各組分的降脂活性結(jié)果Fig. 3 Hypolipidemic effects of fractions from Sephadex G-25 chromatography

如圖2所示，超濾組分A3經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析后分離得到3 個組分，分別為B1、B2、B3。收集各組分，凍干后測定降脂活性。如圖3a所示，組分B2的胰脂肪酶抑制率（40.9%）和膽固醇膠束吸附率（60.3%）均顯著（P＜0.05）高于其他組分。通過圖3b不同濃度下各組分對細胞活性的影響結(jié)果，將各組分配成80 mg/L的質(zhì)量濃度進行細胞實驗。從圖3c、d可知，與對照組相比，經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的模型組和實驗組的細胞總酯含量均顯著升高（P＜0.01），表明細胞已誘導(dǎo)為成熟脂肪細胞。組分B2的脂質(zhì)積累顯著（P＜0.05）低于模型組，且可降低22.39%總膽固醇和20.18%甘油三酯的含量，其降脂能力明顯（P＜0.05）高于其他組分，因此選擇組分B2進行下一步的分離純化。

2.3 榛仁分離蛋白降脂肽Sephadex G-15分離純化

圖4 組分B2 Sephadex G-15分離譜圖Fig. 4 Chromatogram of fraction B2 separated on Sephadex G-15

進一步對組分B2進行Sephadex G-15分離得到C1、C2、C3、C4四個組分（圖4）。將各組分收集凍干進行降脂活性驗證，由圖5a可知，C3組分的胰脂肪酶抑制率（48.3%）及膽固醇膠束吸附率（65.9%）顯著高于其他組分（P＜0.05）。從圖5b的細胞活性實驗結(jié)果，將各組分質(zhì)量濃度配制成80 mg/L進行后續(xù)實驗。由圖5c、d可知，與對照組相比，經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后的細胞脂質(zhì)含量顯著提高（P＜0.01），表明各組前脂肪細胞均誘導(dǎo)為成熟的脂肪細胞，且經(jīng)多肽處理后細胞分化未受到明顯抑制。與模型組相比，C3組分可抑制總膽固醇（26.48%）及甘油三酯（22.66%）的合成，顯著（P＜0.05）降低細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。因此，選擇C3組分進行下一步分離純化。

圖5 Sephadex G-15分離純化B2各組分的降脂活性結(jié)果Fig. 5 Hypolipidemic effects of fractions derived from Sephadex G-15 chromatography

2.4 榛仁降脂肽的反相高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定及活性驗證

圖6 C3組分的反相高效液相色譜圖Fig. 6 RT-HPLC analysis of fraction C3

圖7 FLLPH的二級質(zhì)譜圖Fig. 7 Tandem mass spectrum of FLLPH

圖8 FLLPH的降脂活性結(jié)果Fig. 8 Hypolipidemic effects of FLLPH in 3T3-L1 preadipocytes

將C3組分經(jīng)反相高效液相色譜分離后，得到P1、P2、P3、P4四個組分（圖6）。P3經(jīng)反相高效液相色譜驗證為單一峰（圖6角圖）。將P3組分收集后經(jīng)質(zhì)譜（圖7）鑒定其氨基酸序列。根據(jù)肽段序列的可信度及構(gòu)效關(guān)系篩選出一個分子質(zhì)量為313.686 3 Da的多肽Phe-Leu-Leu-Pro-His（FLLPH）。由圖8a可知，80 mg/L的FLLPH對細胞活性沒有影響。由圖8b、c可知，經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后的前脂肪細胞均分化為成熟的脂肪細胞，且與模型組相比，可抑制總膽固醇（32.67%）和甘油三酯（23.87%）的生成，同時可顯著（P＜0.05）降低細胞內(nèi)26.31%脂質(zhì)的積累。多肽降脂活性與氨基酸的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，有文獻報道，多肽的降脂活性與多肽序列中疏水氨基酸的含量有關(guān)，分子質(zhì)量在1 000 Da以下的小肽[26-28]。且Pak等[29]研究發(fā)現(xiàn)，具有降脂活性的肽段中疏水區(qū)域含4 個氨基酸，并在肽鏈出N端外的任何區(qū)域含有關(guān)鍵組成脯氨酸（Pro）殘基。本研究得到的肽段FLLPH中疏水區(qū)域占較大的比例為80%，含Pro殘基與相關(guān)報道結(jié)果相符。

3 結(jié) 論

本研究從長白山榛仁分離蛋白中分離篩選出降脂活性肽Phe-Leu-Leu-Pro-His（FLLPH），分子質(zhì)量為313.686 3 Da。體外降脂活性結(jié)果表明，F(xiàn)LLPH可有效抑制3T3-L1前脂肪細胞分化過程中總脂的形成，并顯著降低膽固醇和甘油三酯水平。FLLPH雖具有很好的體外降脂活性，但其相關(guān)作用機理尚未明確，后期將從AMPK、PPARγ等降脂細胞信號通路出發(fā)，明確關(guān)鍵作用靶點，進一步探明其降脂作用機理。另外，榛仁分離蛋白活性肽在高脂動物模型中是否會起到降脂減肥作用還需明確。本研究可為榛仁降脂活性肽的開發(fā)提供理論參考。