基于培養基法和高通量測序法分析冷藏小龍蝦優勢腐敗菌

江楊陽，楊水兵，余海霞，姚潔玉，胡亞芹,*

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，馥莉食品研究院，智能食品加工技術與裝備國家（地方）聯合實驗室，農業部農產品產后處理重點實驗室，農業部農產品營養功能評價實驗室，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310058；2.浙江大學舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021）

小龍蝦，學名克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii），作為一種重要的經濟蝦類，廣泛分布在我國長江中下游地區。其肉質肥美、鮮嫩，倍受消費者青睞，現已逐步形成了集“苗種繁育、健康養殖、加工出口、餐飲物流、節慶文化”于一體的產業鏈[1]。與其他水產品類似，在運輸、貯藏過程中，極易受微生物活動、化學氧化和酶反應3 種破壞機制的影響，致其品質快速劣變[2]。小龍蝦屬于甲殼類水產品，擁有更多細菌生長基質的自由氨基酸，故更易遭受微生物破壞[3]。為抑制腐敗微生物活動，目前應用最為廣泛的方法是低溫冷藏。但即使在冷藏過程中，小龍蝦貨架期仍受到特定腐敗菌的影響，且這類特定菌隨著貯藏時間延長，其數量逐漸占據優勢地位，故又將這類特定腐敗菌稱為優勢腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）。

培養基鑒定法是較為常用的鑒定優勢腐敗菌的方法，主要是通過在各種選擇性培養基上培養、篩選不同的菌種后，提取這些單菌落DNA，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增后測其基因序列，再對比確定菌株種類。現已有報道將該方法應用于商業海洋魚類[4]、冰鮮銀鯧魚[5]、冷卻豬肉[6]的優勢腐敗菌鑒定。但該方法存在較大缺陷，特別是挑選單菌落時易受主觀因素影響，導致腐敗菌遺漏；此外，部分環境微生物對環境要求苛刻，用該方法分離出來的微生物僅占微生物總數的1%～10%[7]。

高通量測序法（2 代測序法）不僅可有效將測序時間縮短至幾天甚至幾個小時，能同時測序幾十萬至幾百萬條DNA分子，還能檢測出對環境要求苛刻及低豐度的微生物，有效彌補傳統培養基鑒定法的不足[8]。目前已廣泛應用分析土壤[9]、腸道[10]等的微生物組成。基于此，該方法應用于鑒定水產品腐敗菌相的報道也逐年增加。Cao Rong等[11]用高通量法鑒定冷藏超高壓滅菌牡蠣的優勢腐敗菌；江艷華等[12-13]將高通量測序法用于鑒定冷凍南極磷蝦及蝦夷扇貝柱的腐敗菌相組成；鄧曉影等[14]用高通量法鑒定南美白對蝦腐敗菌相。但其用于鑒定小龍蝦腐敗菌的研究尚鮮見報道。本實驗應用高通量測序法分別鑒定冷藏小龍蝦的鮮樣、腐敗中期樣及腐敗末期樣所對應的優勢菌群，并將其腐敗末期鑒定結果與培養基鑒定法進行比較，驗證高通量測序法精準、高效性的同時，準確分析小龍蝦物流貯運加工過程中的優勢腐敗菌，旨在為冷藏小龍蝦的腐敗機理解析及其保鮮研究提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

鮮活的小龍蝦樣品（質量約40～50 g），購于江蘇盱眙。挑選無病態、活力足的小龍蝦若干只，將其進行去頭處理后放置4 ℃冰箱冷藏至腐敗。

氯化鈉、硼酸、MgO、鹽酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司。

大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養基、BP培養基、假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養基、結晶紫膽鹽葡萄糖中性紅瓊脂（VRBGA）培養基、MR瓊脂培養基、孟加拉紅培養基、營養肉湯 山東青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ZDDN-II自動定氮儀 浙江托普有限公司；HE-120核酸電泳儀 上海天能有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值測定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》。以20 g/L硼酸為吸收液，0.01 mol/L鹽酸滴定，精確稱量5 g研碎蝦肉于750 mL的蒸餾管中，加入0.5 g MgO和少許去離子水，連接到定氮儀上測定。

1.3.2 菌落總數測定

采用?zogul等[15]的方法并略有改動。在無菌條件下稱取10 g蝦肉（取蝦肉肌肉混合樣），絞碎于90 mL滅菌蒸餾水中。充分振蕩、搖勻，制成樣品菌懸液，并進行梯度稀釋。選擇合適的稀釋梯度，取1 mL于無菌平板中，用平板傾注法倒平板。待平板凝固后，倒置放在37 ℃烘箱培養48 h后數其菌落數。

1.3.3 單菌落的分離和純化

將小龍蝦放置在4 ℃冷藏至腐敗，參照1.3.2節方法制得樣品菌懸液，梯度稀釋后，選取合適的稀釋度吸取0.1 mL于多種選擇性培養基平板上均勻涂布，后放置在培養箱中培養24～48 h。挑選各培養基中典型菌落，平板劃線2～3 次，得到純化的單菌落于－80 ℃冰箱中保存。

1.3.4 無菌蝦肉的制備

參照唐文靜等[16]的方法略有改動。將蝦去殼，于無菌條件下用無菌水沖洗，用75%乙醇溶液擦拭蝦肉表面，并放置在紫外條件下晾干。

1.3.5 單菌落優勢腐敗菌的篩選

對各單菌株進行致腐能力測定分析以確定冷藏小龍蝦的優勢腐敗菌，致腐能力的測定以TVB-N值和菌落總數為評定依據。

將提取保存的菌株活化后制成菌懸液，通過平板傾注法確定各菌液的濃度，調整菌液濃度約為106CFU/mL。將制備好的無菌蝦肉分別浸入各菌液中10 s后取出，放置無菌平板中，于4 ℃冷藏。分別測定其在0、3、6、9、12 d的TVB-N值和菌落總數，以確定優勢腐敗菌。TVB-N值和菌落總數的測定方法參照1.3.1節和1.3.2節。

1.3.6 單菌落優勢腐敗菌的分子生物學鑒定

將各優勢腐敗菌于營養肉湯中培養12 h，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的DNA，作為16S rDNA序列擴增反應模板。PCR體系為細菌16S rDNA序列擴增模板2 μL、引物27f和1492r各2 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次后，再在72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。取10 μL的PCR擴增產物進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠電泳中條帶清晰，無明顯拖尾的PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）中的BLAST對各菌株序列分析比對，選取同源性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26軟件進行多重序列對比，并構建Neighbor-Joining系統發育樹，以確定優勢腐敗菌種類[17]。

1.3.7 高通量測序法鑒定優勢腐敗菌

選取貯藏期為0、2、8 d的小龍蝦肉，制成樣品菌懸液，直接提取菌懸液的DNA。將提取得到的DNA進行PCR擴增后，再進行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠電泳中條帶清晰，無明顯拖尾的DNA樣品送至南京諾唯贊生物科技有限公司進行高通量測定分析。

1.4 數據及圖像處理

每組實驗進行2～3 次平行。數據及圖像分別采用Excel和Origin 8.5進行處理。

2 結果與分析

2.1 冷藏期間小龍蝦TVB-N值及TVC值變化

TVB-N值是用作評判蝦肉腐敗程度的重要指標之一，是三甲胺、二甲胺、氨等揮發性胺類物質的總和。這些胺類物質是在貯藏期間，由于微生物和內源酶的雙重作用下，降解蝦肉蛋白和非蛋白物質產生的[18]。根據GB 10136—2015《動物性水品衛生標準》規定，TVB-N值不高于30.00 mg/100 g為合格品。

圖1 冷藏小龍蝦TVB-N值的變化Fig. 1 Change in TVB-N value in red swamp crayfish during cold storage

如圖1所示，貯藏初期，數值增長較為平緩，而當達到30 mg/100 g的安全限值時，增長顯著增加。小龍蝦TVB-N初始值為5.6 mg/100 g，貯藏第2天數值為18.76 mg/100 g，而貯藏第8天后，其數值已達到45.36 mg/100 g，伴隨較為強烈的氨臭味，可知已達到小龍蝦的貨架期終點。

圖2 冷藏小龍蝦菌落總數的變化Fig. 2 Change in total bacterial count in red swamp crayfish during cold storage

如圖2所示，菌落總數隨貯藏時間的延長而增加，并在第6天達到6.82（lg（CFU/g）），超過無公害水產品安全限值所規定的6.0（lg（CFU/g）），表示已到達小龍蝦的貨架期。相比TVB-N值，菌落總數預示的貨架期終點稍早，可能是由于細菌的增長主導TVB-N的產生，故其增長滯后于菌落總數的增長。這一結果與符莎露[19]所研究的哈氏仿對蝦結果一致。結合TVB-N值與菌落總數結果，可認為貯藏0、2、8 d分別為小龍蝦鮮樣期、腐敗中期和腐敗末期，在此時間節點提取小龍蝦樣品總DNA，用于高通量測序。并同時在第8天進行小龍蝦疑似單菌落優勢腐敗菌的提取。

2.2 培養基鑒定法

2.2.1 優勢腐敗菌的分離

蝦肉樣品通過稀釋涂布平板和平板劃線法，根據菌落的形態、顏色差異，在TSA、BP、CFC、MRS、VRBGA、孟加拉紅6 種培養基上，分別分離出4、2、2、1、2、0共11 株菌株。編號依次為T1、T2、T3、T4、B1、B2、C1、C2、M、V1、V2。

2.2.2 優勢腐敗菌的腐敗特性

將上述11 株菌制成菌懸液，并將菌濃度調至106CFU/mL后，分別接種無菌小龍蝦肉，研究冷藏時間對接種蝦肉TVB-N值的影響，結果如圖3所示。實驗組的TVB-N值均高于對照組，且在第6天時，絕大部分實驗組的TVB-N值已超出30 mg/100 g，而對照組在第9天時，其TVB-N值仍未到達這一限值。貯藏至第12天時，對照組的TVB-N值為39.39 mg/100 g，而實驗組T2組最大，為82.41 mg/100 g，V2組最低，為50.45 mg/100 g。故確定這11 株菌株均為小龍蝦的優勢腐敗菌。

圖3 優勢腐敗菌對小龍蝦TVB-N值的影響Fig. 3 Change in TVB-N value during storage of crayfish inoculated with suspected dominant spoilage bacteria

圖4 優勢腐敗菌對小龍蝦菌落總數的影響Fig. 4 Change in total bacteria count during storage of crayfish inoculated with suspected dominant spoilage bacteria

為驗證這些菌株的腐敗能力，將11 株菌株接種到無菌小龍蝦肉上，研究其對小龍蝦肉菌落總數的影響。如圖4所示，當貯藏第6天時，T2、T3、T4、B1、B2、C1、V1組均超過無公害水產品安全限值所規定的6.0（lg（CFU/g）），而對照組則在第12天時才超出這一限值。貯藏至第12天時，菌落總數從高至低依次為C2、T2、V1、T3、C1、T1、B1、B2、T4、M、V2，分別達到7.87、7.54、7.52、7.50、7.45、7.36、7.31、7.25、7.12、7.10、7.10（lg（CFU/g）），高于對照組6.56（lg（CFU/g））。結合TVB-N值，可知致腐能力最強的腐敗菌為C2、T2、V1、T3、C1，較弱的為T4、M、V2。

2.2.3 優勢腐敗菌的分子鑒定

利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測冷藏小龍蝦優勢腐敗菌的16S rDNA擴增產物，均在1 500 bp左右得到特異性條帶，電泳圖譜如圖5所示。

圖5 冷藏小龍蝦優勢腐敗菌的16S rDNA電泳圖譜Fig. 5 Electropherogram of PCR amplified 16S rDNA genes from four dominant spoilage bacteria in red swamp crayfish

圖6 基于16S rDNA序列的同源性菌株系統發育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rDNA sequences

將測序所得序列使用NCBI的BLAST分析，選取同源性在98%以上的菌株序列，利用軟件MEGA 7.0.26進行對比，構建Neighbor-Joining系統發育樹（圖6）。菌株T1～T4分別屬于金黃桿菌（Chryseobacterium anthropi）、微球菌屬（Micrococcus endophyticus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium himgiriensis）、噬冷菌屬，B1、C1屬于希瓦氏菌屬，B2為格氏乳球菌屬（Lactococcus garvieae），C2為氣單胞菌，M～V2則分別為巨型球菌屬（Macrococcus caseolyticus）、糞腸球菌屬（Enterococcus faecalis）、弗氏檸檬酸桿菌。

結合致腐能力分析，可知氣單胞菌、微球菌屬、糞腸球菌屬、微小桿菌屬、希瓦氏菌屬致腐能力最強，巨型球菌屬和弗氏檸檬酸桿菌致腐能力較弱。Macé等[20]研究熱帶熟蝦，發現致腐能力最強的是希瓦氏菌。唐文靜等[16]指出冷藏海鱸魚中致腐能力最強的是草莓假單胞菌。致腐能力的差異可能由物種、菌種差異所致。

2.3 高通量測序法鑒定優勢腐敗菌

2.3.1 PCR擴增結果及微生物數量分析

小龍蝦不同腐敗時期的總DNA提取物，經PCR擴增V3～V4可變區后瓊脂糖凝膠電泳如圖7所示。均在1 500 bp處有特異性條帶，純度達到送檢要求。

圖7 高通量測序法下V3～V4可變區DNA電泳圖Fig. 7 Electropherogram of PCR-amplified V3-V4 variable region

采用Uclust分類法，將拼接好的序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），根據貯藏時間0、2、8 d所對應的OTU繪制韋恩圖。如圖8所示，3 個不同時期共有的微生物共有102 種。鮮樣期與腐敗中期共有微生物121 種，低于腐敗中期與末期共有的413 種。說明腐敗中期與腐敗末期的物種相似度很高，產生差異的OTU豐度較低。

圖8 不同貯藏時期小龍蝦OTU韋恩圖Fig. 8 Venn diagram of OTUs in red swamp crayfish at different storage times

2.3.2 物種多樣性分析

Alpha多樣性多用于評價微生物菌群的豐富度及其個體分配均勻性[21]。常用的度量指數包括Shannon、Simpson、Chao1等。其中，Shannon和Simpson為群落多樣性指數，數值越大，表明菌落多樣性越高。而Chao1指數則用于表示樣品菌群豐富度，Chao1指數越大，菌落豐富度則越高[22]。

表1 小龍蝦不同貯藏時期菌群的alpha多樣性比較Table 1 Alpha diversity of bacterial fl ora in crayfish at different storage times

由表1可知，3 個時期有效序列范圍為17 034～29 324 條。在相似水平97%上對其進行聚類分析（OTU），得到鮮樣的OTU數為452，腐敗中期OTU數為434，腐敗末期OTU數為327。表明隨著貯藏時間延長，小龍蝦的微生物種類呈現降低趨勢。此外，與鮮樣組比較，蝦肉中期及末期組的Shannon、Simpson、Chao1指數均減小，說明蝦肉樣品中微生物物種多樣性和豐富度均下降。其中，Simpson指數變化較小，這是由于該數值主要綜合體現物種的豐富度和均勻度，但不只是考慮種類數目的變化，還考慮了種類之間的配比變化。數值變化不大，則說明盡管物種種類數目有一定變化，但整體各物種間的相對比例變化不明顯。由此可以驗證特定腐敗菌的生長繁殖抑制其他微生物菌群生長結論的正確性。

稀釋曲線是以測序數量及其對應的OTU數構建的、可用來評估樣品中微生物群落物種豐度的曲線[23]。其可直接反映測序數量的合理性，并可通過物種變化趨勢間接反映樣品物種的豐度[24]。如圖9A所示，當樣品測序數超過16 000時，其稀釋曲線趨于平緩，表明測序數量比較合理，再次增加測序量，只會產生極少新OTU，故其基本已覆蓋到樣品中所有的物種[25]。Shannon曲線（圖9B）也在此處趨于平緩，說明測序數量足夠充分合理，已包含所測樣品中絕大多數菌群信息。

如圖10所示，描述物種相對豐度情況。在相對豐度曲線圖的水平方向（X軸），曲線寬度反映物種豐度，即曲線在X軸上的范圍越大代表物種豐度越高；曲線形狀的平滑度反映物種組成的均勻程度，一般曲線越平滑，物種分布越均勻[26]。從圖10可知，3 組樣品在X軸上的分布長度由0、2、8 d依次遞減，表明0 d的物種豐度最大，8 d豐度最小。此外，8 d豐度曲線的陡峭程度大于其他兩組，說明該組樣品菌群組成分布最不均勻，其內部可能存在比列較大的菌群。

圖9 不同貯藏時間小龍蝦樣品稀釋曲線（A）和Shannon曲線（B）分析Fig. 9 Rarefaction curves (A) and Shannon curves (B) of crayfish at different storage times

圖10 不同貯藏時間小龍蝦樣品微生物等級豐度曲線Fig. 10 Rank abundance curves of bacterial species in crayfish at different storage times

2.3.3 菌相組成分析

小龍蝦在冷藏期間的全部菌落按屬分類主要包括動球菌屬希瓦氏菌、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、金黃桿菌屬、不動桿菌屬、嗜冷菌屬、巨型球菌屬、布丘氏菌屬（Buttiauxella sp.）、微球菌屬、肉食桿菌、異常球菌屬（Deinococcus sp.）、環絲菌屬、氣單胞菌屬、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、節桿菌屬（Arthrobacter sp.）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium sp.）、漫游球菌屬、羅氏菌屬（Rothia sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）等。

如圖11所示，腐敗末期樣品占據主要地位的菌屬依次為希瓦氏菌、肉食桿菌、環絲菌屬、嗜冷菌屬、漫游球菌屬、不動桿菌屬，六者之和物種豐度占據90.57%。與鮮樣菌屬比較，除不動桿菌屬由初期的4.76%下降至2.19%，其他5 種比列均上升。希瓦氏菌由10.04%升至63.19%，肉食桿菌、環絲菌屬均由0.02%分別升至7.33%、6.48%，嗜冷菌屬和漫游球菌屬則分別由1.91%、0.20%升至6.32%和2.93%。吳海虹等[27]比較不同包裝方式下冷藏青蝦菌群差異，發現空氣冷藏條件下，優勢菌群主要是不動桿菌、黃桿菌和希瓦氏菌；黃佳奇[26]發現空氣條件下，冷藏小黃魚的優勢腐敗菌主要是希瓦氏菌屬、變形桿菌屬、普羅威斯登菌屬和動性球菌屬，可見優勢腐敗菌存在品種差異。

與傳統培養基法相比，高通量測序法檢測到的菌種類更多。除分離的11 株單菌外，高通量法還檢測到黃桿菌屬、布丘氏菌屬、微球菌屬、肉食桿菌、異常球菌屬、環絲菌屬、叢毛單胞菌屬等。故該方法可提高菌種數量測定的準確性，彌補傳統法肉眼識別的遺漏欠缺，有效提升菌種鑒定水平，且可直接得到對應菌種所占的比列，極大滿足研究需要。但較培養基法而言，其測序所耗時間也有所延長。

圖11 不同貯藏時間小龍蝦樣品微生物物種組成（屬水平）Fig. 11 Bacterial community composition at genus level in crayfish at different storage times

3 結論與討論

本實驗利用傳統培養基法和高通量測序法分析測定冷藏小龍蝦菌屬變化情況，傳統法提取的11 株菌株基本全包含在高通量法測序結果菌株中，可以驗證高通量法的高效、精準性。傳統法共分離11 株菌株，并對這些菌株進行致腐能力測定，結果表明氣單胞菌致腐能力最強，弗氏檸檬酸桿菌致腐能力最弱。高通量法則分別比較小龍蝦鮮樣期、腐敗中期及腐敗末期菌屬變化，發現隨著貯藏時間延長，菌屬多樣性下降但某些菌屬的豐度呈現上升趨勢，尤其在腐敗末期時，希瓦氏菌、肉食桿菌、環絲菌屬、嗜冷菌屬、漫游球菌屬、不動桿菌屬6 種菌屬共占據物種豐度的90.57%，證實特定腐敗菌的生長繁殖會抑制其他微生物菌群生長，并可以確定小龍蝦的優勢腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌、環絲菌屬、嗜冷菌屬、漫游球菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌、束毛球菌屬等。

已有研究表明希瓦氏菌屬和假單胞菌屬為海產品的主要優勢腐敗菌，而假單胞菌屬則為淡水產品的優勢腐敗菌[28]。目前已證實大黃魚在低溫貯藏條件下的優勢腐敗菌為希瓦氏菌[29]，而廣州鯽魚、鳊魚和羅非魚3 種淡水魚的優勢腐敗菌為假單胞菌屬[30]。但本實驗得到淡水小龍蝦的主要優勢腐敗菌希瓦氏菌等，這與已有結論略有差異。可能是由于水產品的種類、生活水域、捕捉方法以及貯藏方式的不同使其特定腐敗菌也不同[31]。此外，希瓦氏菌具有強大的代謝系統，能適應多種鹽濃度、溫度及氣體環境等，是一種嗜冷性及產硫能力極強的菌屬。故其在冷藏至腐敗末期，含量劇增，成為冷藏小龍蝦的優勢腐敗菌屬之一。本實驗結果可為后期研究抑制優勢腐敗菌生長、延長小龍蝦貨架期提供參考基礎。