昌黎產區酒類酒球菌（Oenococcus oeni） 的遺傳多樣性及系統發育分析

余東亮，石 侃，孟 強，劉樹文,3,4,*，何 玲

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.秦皇島金士國際葡萄酒莊有限公司，河北 昌黎 066600；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100；4.陜西省合陽葡萄試驗示范站，陜西 渭南 715300；5.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）是優質葡萄酒釀造中必不可缺的工藝技術[1]。MLF對葡萄酒具有降酸、改善口感、增加風味復雜性及微生物穩定性的重要作用[2]。事實上，由于乙醇發酵結束后，葡萄酒高乙醇含量、低pH值和一定濃度的SO2等嚴苛條件，常引起MLF的延遲或停滯，加之不同種類葡萄酒乳酸菌的存在，增加了代謝風險物質如組胺等的產生，MLF成為相對于乙醇發酵更為難以控制的發酵過程[3-6]。

研究發現，酒類酒球菌（Oenococcus oeni）是營養缺陷型細菌，卻能更好地適應葡萄酒的嚴苛生境，是推動MLF的主導菌及葡萄酒最終質量風格的塑造者，且它們的MLF發酵特性存在菌株水平的特異性[7-11]。此外，不同的葡萄酒生境中O. oeni資源存在多樣性和特異性，賦予產品地域特色[12-14]。因此，篩選本土優良O. oeni菌株不僅能推動MLF順利進行，而且能滿足市場對產品多樣化及產品典型性的需求[15]。Ruiz等[16]從西班牙卡斯蒂利亞-拉曼恰（Castilla La Mancha）產區丹魄（Tempranillo）葡萄酒中，篩選出本土的O. oeni優良菌株C22L9，證實該菌株賦予葡萄酒獨特的產區感官特色。目前，西班牙、意大利、阿根廷和智利等發達的葡萄酒生產國愈加重視并開展本土O. oeni優良菌株的研究和開發[17-21]。因此，在菌株水平對我國葡萄酒產區O. oeni進行遺傳多樣性及其系統發育研究，為開發利用我國本土O. oeni種質資源，推動我國葡萄酒產業發展具有重要意義。O. oeni缺乏錯誤修配基因（mutS和mutL，它們具有糾正多種堿基對的錯配，防止產生過多突變），被認為具有超突變性[22]；而一些研究證實O. oeni不同菌株間存在高度的保守性[23-25]。由于O. oeni這種高突變性和高保守性的矛盾，因此，在對O. oeni進行菌株水平的遺傳研究中，強分辨能力的研究方法十分必要[26]。熒光標記擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術具有操作便捷、分辨率高、重現性好等優點，為研究O. oeni的自然種群與典型的地理環境間的遺傳關系提供了有效途徑[27-29]。

近年來，在我國的葡萄酒釀造過程中，啟動MLF的O. oeni商業制劑幾乎全部來自國外，不利于呈現葡萄酒產品的區域典型性和風格，導致產品同質化[30]，制約著我國特色葡萄酒產業的發展。昌黎產區是我國政府首批“葡萄酒原產地保護區”。該產區在葡萄酒釀造過程中，啟動MLF的O. oeni商業制劑幾乎全部來自國外的LAFFORT公司和LALLEMAND公司，且型號單一，致使葡萄酒產品同質化嚴重。因此，本研究采用熒光標記AFLP技術，對篩選自昌黎產區不同酒莊的222 株O. oeni進行遺傳多樣性和發育規律的研究，以期為開發利用我國不同產區內本土O. oeni種質資源，助力我國特色葡萄酒產業發展，提供方法和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

226 株分離株篩選自昌黎產區5 家具有代表性酒莊，見表1。O. oeni菌株SD-2a和31-DH作為模式菌株，分別來自西北農林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室和中國食品發酵工業研究院。采用葡萄酒生境中分離的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）xja1和xj20，植物乳桿菌（L.plantarum）xj14、xj25和xja2，馬里乳桿菌（L.mali）xja7和xja8作為參照菌株，均來自西北農林科技大學葡萄酒學院微生物實驗室[31]。

表1 分離菌株及來源Table 1 Isolated strains and their origins

蘋果酸監測采用愛爾蘭Megazyme L-Malic Acid（LMALATE）試劑盒；RNase、DNA polymerase、內切酶EcoRI和MseI、T4 DNA Ligase 日本TaKaRa公司；引物及熒光標記引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

ATB培養基：1 L含蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，葡萄糖10 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，鹽酸半胱氨酸0.5 g，番茄汁250 g，調節pH值至4.8。

ATB固體培養基：每1 L ATB液體培養基加入20 g的瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

C1000基因擴增儀 新加坡Bio-Rad公司；Veriti梯度擴增儀 美國基因有限公司；Nanodrop ND-1000核酸蛋白儀 英國BioDrop公司；ChampGel 500 plus全自動凝膠成像系統 北京賽智創業科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣的選取

據昌黎產區地理分布特點，選取5 家具有代表性的酒莊，于2016年榨期葡萄酒乙醇發酵結束后，立即采用消毒容器從葡萄酒發酵罐（其中金士小味兒多為5 t發酵罐，其他均為20 t發酵罐）中直接取樣，避免接種O. oeni商業制劑的污染。酒樣基本理化指標見表2。

表2 酒樣基本理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of wine samples

1.3.2 細菌的分離

酒樣取回后，分裝于消毒后500 mL長頸燒瓶內封好，放置20 ℃恒溫培養箱中，監控自發MLF，一式三份。監測酒樣中蘋果酸含量消耗變化，每個酒樣分MLF前期、中期（蘋果酸消耗50%～70%）、后期（剩余蘋果酸＜20%）取樣。分別取0.1 mL酒樣，使用0.85%生理鹽水（滅菌）稀釋10－1～10－6梯度，采用O. oeni的ATB分離培養基涂平板[32]，培養皿封嚴后，于26 ℃恒溫厭氧培養3～8 d。待平板長出菌落后，按表型差異（生長時間和菌落大小等），挑選單菌落。隨后，采用滅菌ATB培養基進行單菌落培養和劃線分離，反復純化2 次后，用20%滅菌甘油保存于－20 ℃備用。

1.3.3 細菌總DNA的提取

參考Cappello等[27]方法有改動。分離株和模式菌株于ATB培養基培養，參照菌株于MRS培養基培養，均至對數生長期，提取DNA。提取過程中，添加RNase，提高DNA純度。提取模板DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測質量。濃度由Nanodrop ND-1000核酸蛋白儀檢測。

1.3.4O. oeniSpecies-specific聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

O. oeni特異性引物參照Zapparoli等[33]方法。Forward：5’-TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT-3’；Reverse：5’-ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT-3’。選用反應總體積25 μL：2.5 μL 10× PCR Buffer，20 ng DNA模板，5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序為：94 ℃預變性300 s，1 個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環；72 ℃延伸600 s，1 個循環。反應結束后，PCR產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠系統儀上觀察并記錄結果。

O. oeni引物特異性驗證：采用模式菌株和參照菌株驗證擴增特異性。

1.3.5 熒光標記AFLP分析[34]

1.3.5.1 雙酶切和連接反應

選取內切酶EcoRI和MseI組合。反應總體積20 μL：約200 ng DNA模板，10 UEcoRI于37 ℃保溫酶切4 h。結束后直接添加5 UMseI在60 ℃溫育3 h。酶切結束后80 ℃保溫20 min滅活。然后，添加3 μL的T4 DNA Ligase、EcoRI和MseI接頭，在30 μL總反應中，于16 ℃保溫過夜連接。連接反應結束后，于65 ℃保溫10 min，滅活T4 DNA Ligase。

1.3.5.2 連接產物的預擴增和選擇性擴增

預擴增體系25 μL：2.5 μL 10× PCR Buffer，1 μL DNA模板（雙酶切連接產物），5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序為：94 ℃變性120 s，1 個循環；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環；72 ℃延伸420 s。

選擇性擴增反應體系為25 μL，選擇性擴增引物采用已篩選的E1-M1 FAM組合：2.5 μL 10× PCR Buffer，3 μL DNA模板（預擴增產物稀釋10 倍），5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序為：94 ℃變性120 s，1 個循環；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s（每個循環下降1 ℃），72 ℃延伸120 s，10 個循環；然后，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，20 個循環；最后，60 ℃延伸30 min，于12 ℃保存。

以上反應結束后，均取5 μL擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。電泳檢驗合格，選擇性擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行毛細管電泳檢測。

1.4 數據分析

經ABI377自動測序儀檢測數據，并進行統計分析。其中峰高閾值設定為100，將AFLP檢測指紋圖譜，按照等位基因出現條帶記為1（峰高閾值≥100），未出現條帶記為0（峰高閾值＜100），構建二進制矩陣，采用NTSYS 2.10軟件，基于非加權配對算術平均法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means，UPGMA）進行聚類分析，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 O. oeni Species-specific PCR鑒定

2.1.1 O. oeni引物特異性驗證

圖1 O. oeni的引物特異性驗證PCR電泳結果Fig. 1 Electrophoresis profiles of PCR amplification with O. oeni-specific primers

如圖1所示，O. oeni模式菌株31-DH和SD-2a均可擴增出唯一、清晰的條帶（泳道1、2），約1 025 bp；分離自葡萄酒生境的短乳桿菌、植物乳桿菌和馬里乳桿菌等參照菌株均未能擴增出條帶（泳道4～10），證實Zapparoli等[33]設計的O. oeni Species-specific PCR引物具有典型的特異性。其中，泳道3為分離株11-01，能擴增出和模式菌株相同的單一條帶，證實為O. oeni菌株。隨后，對分離株均進行Species-specific PCR鑒定。

2.1.2 分離株的Species-specific PCR鑒定

來自昌黎產區5 個代表性酒莊的酒樣，經自發MLF，按前、中和后期取樣，采用ATB分離培養基，得到具有表型差異的226 株分離株。226 株分離株均提取有效的DNA，后采用已驗證的O. oeni特異性引物進行Species-specific PCR鑒定。經Species-specific PCR電泳檢測，222 株分離株被確認為O. oeni菌株。4 株分離株1-03、2-26、3-29和3-32經電泳檢測，均沒有特異性條帶出現，確認為非O. oeni菌株。圖2為部分分離株的Species-specific PCR電泳檢測圖，其中分離株2-26（泳道22）沒有特異性條帶，其他22 株分離株均呈現約1 025 bp的唯一特異性條帶，因此，確認2-26為非O. oeni菌株，其他均為O. oeni菌株。

圖2 部分分離株的Species-specific PCR鑒定電泳結果Fig. 2 Electrophoresis profiles of selected isolates identified by species-specific PCR

2.2 222 株O. oeni的熒光標記AFLP分析

2.2.1 分離株的熒光標記AFLP多態性分析

運用熒光標記AFLP技術，采用已篩選的帶有熒光標記選擇性引物E1-M1 FAM組合，在222 株分離株中檢測出287 個位點條帶，其中呈多態性位點條帶數為285 條，多態性位點比率高達99.30%。金剛等[35]認為O. oeni基因組的G＋C含量在40%左右，建立了基于HindIII和MseI組合的AFLP分析體系。基于HindIII和MseI內切酶組合優化的選擇性擴增引物組合，其多態性位點比率在10%～52.90%之間，遠低于本實驗選擇性引物E1-M1 FAM組合的99.30%。隨高通量測序技術的發展，發現O. oeni基因組的G＋C含量在37%左右，在多態性上，內切酶EcoRI和MseI的組合屬于AFLP分析的經典雙酶切組合[36]，優于HindIII和MseI的雙酶切組合。

2.2.2 分離菌株的遺傳多樣性分析

如圖3所示，選擇性熒光標記引物E1-M1 FAM組合，可以將分離自昌黎產區5 個具有代表性酒莊分離的222 株具有表型差異的O. oeni，區分為221 個AFLP遺傳型，相似性系數為74%～98%。分離株1-02和9-51分別來自朗格斯赤霞珠和茅臺赤霞珠，與其他分離株的相似性系數為74%，是最低的。分離株3-07分離自華夏赤霞珠，與其他菌株的相似性系數為75%，居其次。分離自金士小味兒多的106 株O. oeni，有105 個AFLP遺傳型，它們的最小相似性系數為78%，而菌株11-105和11-106的親緣關系最近，其相似性系數為98%。相對而言，分離自仁軒赤霞珠的25 株O. oeni的最小相似性系數為82.5%，高于分離自其他酒莊分離株之間的最小相似性系數。結果表明，分離自5 個不同酒莊的222 株O. oeni展現了菌株間豐富的遺傳多樣性。

由此可見，熒光標記AFLP技術對分離自不同酒莊的O. oeni菌株具有強大的遺傳分型能力，為篩選不同酒莊內O. oeni優良菌株提供了技術方法。脈沖場凝膠電泳之前被認為是O. oeni最為有效的分型技術，然而，該方法對地緣關系較近的菌株不能實現有效區分，且該技術操作要求高，實驗結果不夠穩定[37-38]。隨機擴增片段長度多態性DNA-PCR在O. oeni分型研究中，具有經濟、快速和高靈敏性的特點，但是存在低重現性的缺陷[39,5]。數目可變串聯重復序列分析技術展示了強有效的遺傳分型能力[40-41]，然而，由于目前對重復序列的遺傳功能的認識還有限，基于重復序列的遺傳分析受到微生物學家的質疑[42]。基于RNA水平的差異顯示PCR技術受環境影響大，重現性差[26]。本實驗中，基于全基因組進行的雙酶切熒光標記AFLP指紋圖譜技術，精確度高，分辨力強且經濟簡便，不僅將分離自昌黎產區不同酒莊的O. oeni菌株實現有效的分型，且對來自同一酒莊的O. oeni菌株也可實現分型。

圖3 昌黎產區222 株O. oeni的AFLP遺傳圖譜分析Fig. 3 UPGMA dendrogram derived from AFLP patterns of 222 O. oeni strains from Changli

高通量測序技術使得對O. oeni在全基因組水平實現遺傳分型和發掘其遺傳進化規律成為可能[43]。然而，酒類酒球菌基因組較小，基于高通量技術積累的豐富數據，如何進行深入挖掘和生物信息學分析，還存在較大的挑戰[44-45]。此外，在O. oeni菌株水平上進行遺傳分型的研究中，高通量測序還存在成本高的問題。因而，具有經濟簡便、分辨力強的分子標記技術，如熒光標記AFLP技術在O. oeni的遺傳進化分析中仍具有不可取代的作用。

2.2.3 分離菌株的遺傳發育分析

基于UPGMA分析方法，對分離自昌黎產區的222 株O. oeni構建的系統發育樹見圖3。在相似性系數為81.7%處，222 株分離株呈現出清晰的A和B兩個主要的進化類群。這與國內外基于序列和全基因組分析得出的O. oeni遺傳進化規律是一致的[34,46]。在這2 個主要類群中，A類群菌株全部分離自朗格斯酒莊、仁軒酒莊和茅臺酒莊，說明這3 個酒莊的O. oeni菌株具有相近的進化關系；而B類群菌株來自金士酒莊和華夏酒莊，說明它們之間的進化關系較為緊密。事實上，金士酒莊和華夏酒莊同屬昌黎產區的碣石山小產區，地理位置和氣候特點較其他3 個酒莊更為接近。在A類群中，存在A1、A2、A3、A4和A5共計5 個清晰的簇群結構，A1（8/9）和A5（17/18）簇群菌株主要來自仁軒酒莊，A2（5/5）簇群的菌株分離自朗格斯酒莊，A3（23/26）和A4（8/8）簇群主要分離自茅臺酒莊，說明這些進化簇群與它們的分離起源具有清晰的遺傳關系，同時，分離自同一酒莊的O. oeni菌株間也存在明顯不同的進化發育途徑。在B類群種，這種進化發育規律尤為明顯，B1（99/102）簇群幾乎均分離自自金士酒莊，B2（5/5）和B3（21/21）簇群全部分離自華夏酒莊。在系統進化樹上，分離自同一酒莊的O. oeni菌株種群形成獨特的簇群結構，揭示了分離自昌黎產區的O. oeni分子遺傳發育規律與其分離起源存在極為典型的特異性關系。

此外，分別來自朗格斯赤霞珠和茅臺赤霞珠的分離株1-02和9-51處于系統進化的最底層，均來源于17 a樹齡的赤霞珠（昌黎產區最早建立的酒莊酒釀酒葡萄基地），或許是昌黎產區O. oeni的系統發育起始菌株。

Knight等[13]通過風味化學分析，驗證了具有區域代表性的釀酒微生物直接對本區域葡萄酒風格特色的影響，提出釀酒微生物屬于葡萄酒“風土”的概念。El Khoury等[14]提出，釀酒微生物是否屬于葡萄酒“風土”組成，從微生物學的角度看，意味著是否存在遺傳獨特、起源不同的微生物種群結構，對6 個世界知名葡萄酒產區的O. oeni菌株種群進行生物地理學分析，在分子遺傳學上，發現不同葡萄酒產區存在獨特的O. oeni的種群結構，推斷O. oeni和釀酒酵母等釀酒微生物同樣屬于葡萄酒“風土”的重要組成之一。然而，其研究并未發現O. oeni種群結構在地理起源上存在遺傳特異性。本研究分離自昌黎產區不同酒莊的O. oeni種群結構，在分子水平上呈現出清晰的遺傳發育和分離起源的特異性關系，進一步證實O. oeni資源是葡萄酒“風土”的重要組成之一。

3 結 論

本研究對分離自昌黎產區5 家具有代表性酒莊的222 株具有表型差異的O. oeni菌株，進行熒光標記AFLP指紋圖譜分析，區分為221 個AFLP遺傳型，證實熒光標記AFLP技術具有極強的遺傳分型能力，揭示了昌黎產區O. oeni豐富的遺傳多樣性。通過UPGMA分析方法，構建分離的O. oeni系統發育樹，可以清晰地看到2 個主要的進化類群，極其重要的是，分離自同一酒莊的O. oeni菌株種群形成了獨特的簇群結構，呈現出遺傳發育和分離起源的典型特異性關系，證實了O. oeni資源是葡萄酒“風土”的重要組成之一。研究結果證實了昌黎產區存在豐富的O. oeni資源，且不同酒莊的O. oeni資源呈現出典型的遺傳特異性，這為開發我國具有地域特色的O. oeni資源提供了技術和理論支持。