羊乳低聚糖超高效液相色譜-質譜鑒定中樣品前處理方法及液相色譜條件優化

張 艷，蘆 晶，張書文，逄曉陽，王軍輝*，呂加平,*

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

乳汁提供了初生哺乳動物生長發育的全部營養需要，其含有豐富的蛋白質、脂肪、乳糖及微量的低聚糖，低聚糖雖然含量少卻對幼小動物發育具有重要的生理活性[1]。乳低聚糖是由3～10 個單糖通過糖苷鍵共價連接的碳水化合物聚糖，構成乳低聚糖的單糖包括葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、N-乙酰葡糖胺（N-acetylglusamine，GlcNAc）、巖藻糖（fucose，Fuc）、N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，NeuAc）和N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminicacid，NeuGc）[2]。大多數的乳低聚糖是以乳糖為核心的結構[3]。

研究發現，乳低聚糖作為益生元能有效促進腸道內有益菌雙歧桿菌的生長，防止致病菌的附著，而降低腹瀉的風險[2,4-5]。乳低聚糖根據末端連接方式的不同，分為酸性乳低聚糖（含有NeuAc和NeuGc）和中性乳低聚糖（含有N-乙酰基葡萄糖）[6-7]。研究證明，乳低聚糖可以調節腸道微生物菌群和提高免疫功能，唾液酸化的低聚糖可以作為Gal的來源用于合成半乳糖腦苷脂，唾液酸用于腦灰質中的神經節苷脂以及糖蛋白合成，促進大腦發育[8-9]。人乳中含有200余種低聚糖[10]，然而，由于大小、電荷和結構的差異性，迄今為止，只有低分子質量的人乳低聚糖可以通過化學方法合成[11-12]。因此，尋找具有類似于人乳低聚糖生物活性的替代品并應用于嬰兒配方食品已引起眾多研究者的關注[13-14]。羊乳是嬰幼兒配方粉的重要乳基料之一，有研究表明羊乳中低聚糖含量約為0.25～0.30 g/L，是牛乳低聚糖含量的8 倍左右[15]，因此，羊乳被認為是潛在的母乳低聚糖替代物資源。羊乳中低聚糖的分離與檢測技術研究已有較多報道，其中研究較為全面和先進的是美國加州大學戴維斯分校的科學與技術系[16-19]。但由于該實驗室采用了特殊的分離柱，使其他單位難以參考或使用，限制了我國或其他國家對乳低聚糖種類和結構的研究，因此，建立有效、通用的羊乳低聚糖檢測手段對我國羊乳低聚糖研究具有重要意義。

乳汁中乳糖含量在碳水化合物中的比例超過80%，而游離乳低聚糖含量只占4%左右，在實驗鑒定中，由于高含量的乳糖幾乎完全掩蓋了低豐度低聚糖的檢測信號，因此，需要對樣品中的低聚糖進行純化富集處理，減少乳糖等雜質的干擾，提高檢測的靈敏度，在質譜鑒定中具有重要意義[20-21]。乳糖和乳低聚糖的分子質量較為接近，分離、富集乳低聚糖和提高檢測靈敏度已成為國內外研究的一個難題，另外，乳低聚糖中同分異構體的分離較為困難，只有通過保留時間才能將其分開，所以超高效液相色譜條件的優化顯得尤為重要。

本研究對比4 種富集方法對乳糖去除率和低聚糖保留率的影響，采用市售的氨基色譜柱結合Q-Exactive Focus質譜儀對富集的羊乳低聚糖進行超高效液相色譜條件優化分析，建立普適的羊乳低聚糖測定的可行方法，為我國羊乳低聚糖研究提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳采自北京市某羊廠泌乳期2 個月的薩能羊；乙腈、甲醇（均為色譜級） 美國Fisher公司；甲酸銨（色譜級） 美國Sigma公司；無水乙醇、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Sep-Pak C18柱（500 mg/4 mL） 美國Waters公司；ME55精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JD-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；ZLS-4真空離心濃縮機 北京金瑞博科技發展有限公司；TECAN SPARK20M酶標儀 上海貿易有限公司；ICS-3000離子色譜儀 美國戴安公司；石墨化碳柱（150 mg/4 mL） 美國Grace公司；Q Exactive Focus液相色譜組合四極桿Orbitrap質譜儀 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳低聚糖檢測樣品蛋白質去除率的測定

取7 mL羊乳，在4 ℃、10 000/min條件下離心30 min，去除上層的脂肪和底部少量的蛋白質，取出中間層轉移到離心管中[22]。加入無水乙醇的比例分別為1∶2、1∶4、1∶6，反應溫度分別為4、－20 ℃和－80 ℃，反應時間分別為2、4 h和12 h，反應結束后4 ℃、4 000×g離心30 min取上清液，用BCA試劑盒于波長562 nm測定蛋白質的含量[23]，最后計算蛋白質的去除率。

1.3.2 羊乳低聚糖的提取

按照1.3.1節優化方法脫脂乳，并用ZLS-4真空離心濃縮儀濃縮備用。

1.3.3 羊乳低聚糖的富集

1.3.3.1 Sep-Pak C18和石墨化碳柱法

首先用5 mL的甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用10 mL（0.1% TFA）超純水溶液沖洗Sep-Pak C18柱[24]。將上述的濃縮液濃縮干燥，溶于400 μL（0.1% TFA）超純水溶液，然后加到Sep-Pak C18柱中。收集洗脫液，將洗脫液再次加入Sep-Pak C18柱中（此步驟重復2 次）。最后用3 mL（0.1% TFA）超純水溶液沖洗Sep-Pak C18柱，收集洗脫液，此洗脫液即為羊乳寡糖的樣品。

羊乳低聚糖的除鹽，采用石墨化碳柱，除鹽步驟包括：活化、平衡、加樣、脫鹽、洗脫等。首先，采用3 倍柱體積80%的乙腈溶液（0.1% TFA）和超純水分別活化和平衡石墨化碳柱。將Sep-Pak C18柱的洗脫液上樣，收集洗脫液（流速0.5～1.0 mL/min），此步驟重復2 次。用3 倍柱體積的超純水沖洗柱子，吸附柱底PGC填料上的低聚糖，以便于除鹽。最后用0.5 mL 10%乙腈溶液（0.1% TFA）、20%乙腈溶液（0.1% TFA）、40%乙腈溶液（0.1% TFA）將低聚糖分步洗脫，分別收集洗脫液備用。

1.3.3.2 超濾膜包法

按照說明書，將壓力表、蠕動泵、儲槽和小型膜包（截留分子質量1 000 Da，膜面積50 cm2）準確連接。打開壓力計，使壓力控制在40 psi，在儲槽中倒入蒸餾水，用pH試紙檢測濾液的酸堿性，當溶液呈現中性時，停止沖洗[25]。倒出剩余的蒸餾水，加入50 mL脫脂、去蛋白的低聚糖檢測樣品進行超濾，取超濾4、5 h和6 h的截留液各1 mL放置在－80 ℃冰箱中備用。

1.3.3.3 透析法

將脫脂、去蛋白濃縮樣品加入到截留分子質量為1 000 Da的透析袋中，放置4 ℃冰箱24 h，每隔8 h換1 次水，換3 次水后，透析袋內溶液不再增加，倒出溶液放置－80 ℃冰箱備用[26]。

1.3.3.4 葡聚糖凝膠層析法

葡聚糖凝膠層析分離原理主要是分子篩作用，在分離的整個過程中，低聚糖在凝膠顆粒中不斷擴散和受到排阻作用，根據分子質量的大小將其分離[26]。

將Sephadex-G10凝膠放置在燒杯中浸泡12 h，然后加入層析柱中（3.6 cm×60 cm），使用超純水流速為5 mL/2 min預壓12 h。將脫脂、脫蛋白濃縮樣品加入Sephadex-G10凝膠柱中，采用超純水為洗脫液，流速為5 mL/2 min，最終低聚糖被緩慢洗脫下來。用自動部分收集器收集餾分，每2 min收集1 管。最后用苯酚硫酸法檢測收集管中有無低聚糖，將含有低聚糖的收集管放入－80 ℃冰箱中備用[27]。

1.3.4 乳糖的定量分析

采用C a r b o P a cTMP A 2 0糖分離柱（3 mm×150 mm），流動相A為超純水，流動相B為250 mmol/L NaOH溶液，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，檢測器為金電極脈沖安培檢測器。梯度洗脫條件：0～40.1 min，7.2%～100% A；40.2～45 min，100% A；45.1～55 min，100%～7.2% A。使用此方法對乳糖進行定量分析，再進一步分析低聚糖峰面積的變化，選擇一種乳糖的去除率較高和低聚糖損失較少的分離、富集方法。

1.3.5 超高效液相色譜條件

ACQUITY UPLC氨基色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；流動相A為乙腈；流動相B為10 mmol/L甲酸銨溶液；洗脫程序：0～20 min，95%～78% A；20～35 min，78%～73% A；35～38 min，73～62% A；38～45 min，62%～50% A。

1.3.6 質譜條件

采用Q-Exactive Focus質譜儀，使用電噴霧離子源；正離子模式，噴霧電壓3.8 kV；負離子模式，噴霧電壓3.4 kV。鞘氣壓力25 arb；輔氣壓力8 arb；加熱溫度350 ℃；毛細管溫度320 ℃。在正負離子模式下對m/z300～2 000的低聚糖進行一級離子掃描。

1.4 數據處理

低聚糖通過GlycoPeakfinder工具在一級質譜的質量誤差小于10×10－6進行匹配查找，采用Orignal 8.0軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 羊乳低聚糖檢測樣品蛋白質去除率測定結果

由表1可知，當脫脂乳與無水乙醇的比例為1∶6，反應溫度在－20 ℃，反應時間為2 h時，蛋白質去除率達到88.55%。與其他4 組相比，此組蛋白質去除率最高，但僅比第2組的蛋白質去除率增加了1.54%。考慮到原料的節省問題，本實驗選擇脫脂乳與無水乙醇的比例1∶2、反應溫度－20 ℃、反應時間4 h作為最優的反應條件。

2.2 羊乳低聚糖檢測樣品中乳糖去除率測定結果

表2 羊乳低聚糖中乳糖去除率Table 2 Removal rate of lactose from goat milk oligosaccharides

圖1 通過透析（A）、超濾膜包（B）、Sep-Pak C18和石墨化碳柱（C）、葡聚糖凝膠層析（D）和未除乳糖的低聚糖粗樣品（E）乳糖和低聚糖的含量變化Fig. 1 Contents of lactose and oligosaccharides in purified extracts by dialysis (A), ultrafiltration membrane package (B), sequential Sep-Pak C18 and graphitized column chromatography (C) and Sephadex chromatography (D), and crude extract samples (E)

由表2可知，透析法乳糖去除率最高，達到99.5%，但是由圖1A可知，乳糖峰面積遠大于低聚糖峰面積，因此乳糖含量遠大于低聚糖含量（乳糖的出峰時間在18.10 min左右，低聚糖的出峰時間在5～15 min左右（圖1B））。這可能是由于透析的過程中，小分子質量的低聚糖隨乳糖透析出去，從而使低聚糖含量降底。

對于超濾膜包法，超濾時間分別為4、5 h和6 h時乳糖去除率分別為34.8%、36.2%、38.4%。3 個不同的時間段，乳糖去除率均比較低。結合圖1B可知，離子色譜峰中僅可以看到乳糖峰，可能低聚糖含量較低，被乳糖峰覆蓋，所以超濾膜包法分離效果較差。

通過Sep-Pak C18和石墨化碳柱法，采用40%乙腈溶液沖洗的洗脫液乳糖去除率較高，達到98.9%。10%乙腈溶液、20%乙腈溶液沖洗的洗脫液乳糖去除率分別為96.4%、84.1%，結合圖1C可知，此方法獲得的低聚糖峰較小，可能因為大部分低聚糖留在柱子未隨過柱液體流出。所以此方法不適合低聚糖分離。

而葡聚糖凝膠層析法乳糖去除率（12～17管收集液混合）高達98.7%，由圖1D可知，低聚糖峰較為明顯且個數較多，一方面說明乳糖大部分被分離，僅有小部分乳糖殘留在低聚糖溶液中。另一方面說明低聚糖損耗較少，大部分低聚糖被洗脫下來。根據低聚糖分子質量大小，大分子低聚糖先被洗脫，小分子質量低聚糖后被洗脫下來，由于乳糖為二糖，因此，乳糖最后被洗脫下來。在圖1D中，隨著洗脫時間的延長，乳糖含量漸漸增加，當收集到17管時，乳糖含量驟增，在圖中看不到低聚糖的峰，由苯酚-硫酸法測定糖含量（收集液100 μL，苯酚100 μL，濃硫酸500 μL），在12管時出現顏色變化，說明在12管時有低聚糖被洗脫下來，因此洗脫液收集12～17管。使用葡聚糖凝膠層析分離乳糖較為理想，因此葡聚糖凝膠層析的洗脫液用于后續超高效液相色譜-Q-Exactive Focus質譜儀分析。

2.3 超高效液相色譜條件的確定

對羊乳寡糖進行超高效液相色譜條件的優化，根據本實驗室以前的研究基礎，初次設定流動相的洗脫條件為：梯度洗脫，0～18 min，95%～68% A；18～30 min，68%～62% A；30～38 min，62%～50% A。如圖2A所示，18～22 min之間的峰并沒有分開。為了更直觀地觀察研究液相色譜條件優化，選取其中的一個低聚糖作為優化對象。Hex2Neu5Ac1-1和Hex2Neu5Ac1-2異構體在正負離子模式下并沒有分開（圖3A）。參照高效液相色譜分離的原則和XBridge氨基柱的特點進行后續的超高效液相色譜條件的優化，梯度洗脫條件為：0～18 min，95%～74% A；18～30 min，74%～69% A；30～38 min，69%～62% A；38～45 min，62%～50% A。優化結果見圖2B，總離子圖譜中保留時間在20～27 min之間的峰沒被分開，但可以看出其他保留時間的峰被明顯分開，Hex2Neu5Ac1-1和Hex2Neu5Ac1-2異構體在正負離子模式下，2 個峰相交的面積明顯減少（圖3B1），說明優化效果顯著。因此，繼續進行高效液相色譜條件優化，優化的結果見圖2C，總離子流圖中的峰在所有保留時間基本被分開，Hex2Neu5Ac1-1和Hex2Neu5Ac1-2異構體明顯被分開，且效果較好（圖3C）。最終梯度洗脫條件為：0～20 min，95%～78% A；20～35 min，78%～73% A；35～38 min，73%～62% A；38～45 min，62%～50% A。

圖2 羊乳中低聚糖的總離子流圖Fig. 2 TIC chromatograms of goat milk oligosaccharides under positive and negative ion modes

圖3 羊乳中低聚糖Hex2Neu5Ac1的異構體總離子流圖Fig. 3 TIC chromatograms of Hex2Neu5Ac1 isomers in goat milk under positive and negative ion modes

2.4 質譜分析

將羊乳低聚糖用優化好的流動相條件通過Q-Exactive Focus質譜儀進行測定。本實驗在正負離子模式條件下同時進行，低聚糖的質量掃描范圍為m/z300～2 000。正離子模式的電離方式有3 種：[M＋Na]＋、[M＋H]＋和[M＋NH4]＋，負離子模式的電離方式有1 種：[M－H]＋。質量精度為10×10－6，構成羊乳低聚糖的單糖包括Glc、Gal、GlcNAc、Fuc、Neu5Ac和Neu5Gc，同時根據一級質譜的質荷比（m/z）可以篩選出低聚糖的單糖組成[22]。

每個樣品設置3 個重復，豐度值取3 次的平均值，樣品的重復性較好，在3 次重復實驗中檢測到低聚糖的個數相同，且豐度值相差不大，相對標準偏差在1%～10%的范圍內，說明儀器的精密度與實驗的重復性較好。

由表3可知，富集前低聚糖樣品在正負離子條件下共鑒定出29 種，在正離子模式下鑒定出23 種低聚糖，而在負離子模式下鑒定出16 種低聚糖，2 種模式下同時鑒定出10 種低聚糖，由被檢測的低聚糖個數可知，只有同時在正負離子模式下才能鑒定出更多的低聚糖種類。由表4可知，采用葡聚糖凝膠層析法富集后的低聚糖樣品，共鑒定出62 種低聚糖，相比富集前樣品多鑒定出33 種低聚糖。Martín-Ortiz等[28]研究表明，在正離子模式、低聚糖的電離方式為[M＋Na]＋條件下鑒定出49 種羊乳低聚糖。本實驗方法大大提高了羊乳低聚糖鑒定的種類。富集前乳糖的豐度為14 342 113，富集后乳糖的豐度為666 062，乳糖的含量減少了95%，從而降低了乳糖在低聚糖鑒定過程的影響。富集前后豐度含量最高的低聚糖為Hex2Neu5Ac1，相似的結論出現在Martín-Ortiz等[28]在山羊初乳的研究中，鑒定出含量最高的低聚糖為Hex2Neu5Ac1。在表3和表4中分別鑒定出11 種和13 種同分異構體，這說明了優化的條件能較好地分離羊乳中的同分異構體，一方面證明了此實驗優化了一種有效、通用的低聚糖分離的條件，另一方面為低聚糖同異構體的研究提供了理論的依據。

由于低聚糖的含量和電離差異性，富集前后鑒定出低聚糖種類并不完全相同，但在富集前后共鑒定出14 種結構相同的低聚糖。一方面，富集前鑒定出的低聚糖在富集后基本被鑒定出（22/29），另一方面，富集后比富集前多鑒定出33 種低聚糖，因此，葡聚糖凝膠層析法適用于羊乳中乳糖的分離。

富集前的低聚糖樣品鑒定出3 種不同的巖藻糖dHex1Hex2、dHex1Hex3-1和dHex1Hex3-2，占鑒定出總糖比例的10.34%，而富集后的低聚糖樣品鑒定出5 種不同的巖藻糖dHex1Hex3-1、dHex1Hex3-2、dHex1Hex6、dHex1Hex7和dHex1Hex7HexNAc1，占總糖比例的8.06%。Martín-Ortiz等[28]的研究也得出相似結果，采用納流液相色譜-串聯飛行時間質譜在羊乳的成熟乳中僅檢測出4 種巖藻糖dHex1Hex3HexNAc1的同分異構體，占被檢測出總糖的8.16%，而在山羊初乳中檢測出3 種低聚糖dHex1Hex1HexNAc1、dHex1Hex3HexNAc1和dHex1Hex2，僅占被檢測出總糖的3.85%[20,28]。原因可能是地域、天氣、飲食、年齡、羊品種以及檢測方法等差異性，使檢測到的低聚糖的結構和種類有很大的區別。而在人乳低聚糖中含有較多比例的巖藻糖，其中大部分可以作為益生元和阻止細菌黏附腸上皮細胞的有效抑制劑[2,29]。在本實驗中共檢測到6 種不同的巖藻糖，存在羊奶中的這些巖藻型低聚糖是一種潛在提高腸道健康的功能性食品。

表3 富集前樣品檢測到的29 種羊乳低聚糖結構Table 3 Structural analysis of 29 milk oligosaccharides before enrichment

表4 富集后樣品檢測到的62 種羊乳低聚糖結構Table 4 Structural analysis of 62 milk oligosaccharides after enrichment

由表3和表4可知，富集前后酸性低聚糖分別占鑒定出總低聚糖的41.38%和58.07%，非巖藻型中性低聚糖分別占鑒定出總低聚糖的48.28%和33.87%。在Martín-Ortiz等[28]的研究中，在山羊乳中非巖藻型中性低聚糖為總糖的51.3%，酸性低聚糖為總糖的44.9%。在本研究中，Neu5Ac占酸性低聚糖的比例為66.67%。在前期研究中，報道了更高比例Neu5Ac的酸性低聚糖[30]。

3 結 論

本實驗采用4 種前處理方法去除羊乳中的乳糖，由離子色譜圖和乳糖的去除率可知，葡聚糖凝膠層析法可以有效去除乳糖并保留低聚糖。采用葡聚糖凝膠層析法在正負離子模式下鑒定出62 種低聚糖，相比富集前鑒定出的29 種低聚糖，多鑒定出33 種低聚糖，取得預期結果。液相色譜優化的最終條件為0～20 min，95%～78% A（乙腈）；20～35 min，78%～73% A；35～38 min，73～62% A；38～45 min，62%～50% A。本實驗脫除乳糖的方法簡單可行、檢測低聚糖方法精確，可用于羊乳低聚糖的分離和鑒定。