基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法的興安升麻甲醇提取物化學成分分析

呂 弘，王曉明,*，劉小梅，張 帆，王獻瑞，郭亞卿，潘桂湘*

（1.天津中醫藥大學 天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 301617；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

興安升麻（Cimicifuga dahurica(Turcz.) Maxim）是毛茛科升麻屬多年生宿根草本植物，又稱北升麻、窟窿牙根、苦老菜根[1]，主產于我國華北、東北地區。興安升麻幼苗可食，根莖為藥用有效部位，即為升麻[2]。2015年版《中國藥典》記載，升麻具有發表透疹、清熱解毒、升舉陽氣等功效，用于風熱頭痛、口瘡、麻疹不透、陽毒發斑、子宮脫垂等病證[3]。升麻屬植物目前發現主要含有9,19-阿爾廷烷三萜皂苷、肉桂酸衍生物等兩大類化合物，此外還有色原酮類、吲哚類生物堿以及其他含氮類化合物[4-5]。其藥理作用除了傳統的抗炎[6]、解熱、鎮痛和抗潰瘍外[7]，還可用于治療婦女絕經、骨質疏松[8-9]、腫瘤[10]等。

升麻可以鮮食，既是藥膳佳肴又是食材良藥。早春可將幼嫩的升麻莖制作后食用，清香爽口，略帶苦味，若與小米粥同食，可變苦為甜；幼葉涼拌菜、炒菜或用作主食菜餡，有較高的食用價值[11]。國家衛生健康委（原衛生部）曾于2002年3月發布《衛生部關于進一步規范保健食品原料管理的通知》文件，將升麻列入可用于保健食品的原料清單。

本實驗利用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）較佳的色譜分離特性和四極桿-飛行時間（quadrupole-time of flight，Q-TOF）良好的質量分辨能力[12]，及亞2 μm填料窄徑柱優越的色譜分離能力，使興安升麻甲醇提取物的眾多成分在色譜上得到較好分離，然后用Q-TOF-質譜（mass spectrometry，MS）采集一級、二級高分辨質譜數據，接著利用Masshunter軟件對原始質譜數據進行分析，根據獲得的化合物精確質量數、色譜保留時間、碎片離子信息等，對興安升麻的化學成分進行解析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

升麻藥材購于河北安國藥材市場，天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為興安升麻。

對照品：北升麻瑞、北升麻寧、升麻酰胺A、反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(＋)-異落葉松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、24-epi-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷均為自制，經紅外光譜、核磁共振、質譜鑒定，質量分數大于98%；咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、升麻素、升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷 中國藥品生物制品檢定研究院。

乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；超純水由Milipore超純水凈化系統制得。

1.2 儀器與設備

1290 UPLC儀、6520 Q-TOF-MS儀 美國Agilent公司；Mill-Q II型超純水器 美國Millipore公司；3K15低溫高速離心機 德國Sigma公司；AX205十萬分之一天平瑞士Mettler Toledo公司；KQ-250E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

供試品：將升麻藥材樣品粉碎，過40 目篩后精密稱取0.25 mg置于10 mL容量瓶，精密加入9.75 mL 80%甲醇，蓋塞超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，靜置放冷至室溫后，80%甲醇溶液補足至刻度，搖勻，濾紙過濾，取續濾液1 mL于14 000 r/min離心10 min，將上清液再用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得供試品溶液。

1.3.2 UPLC條件

色譜柱：Waters Acquity BEHC18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；保護柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量1 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for chromatographic separation

1.3.3 MS條件

電噴霧離子源；渦輪噴射，正負離子模式檢測，質量掃描范圍m/z100～1 000。離子源參數：噴霧電壓3 500 V，碎裂電壓175 V，離子源溫度350 ℃，鞘氣流速10 L/min；噴霧氣壓力35 psi；錐孔電壓65 V。

1.3.4 高分辨質譜數據處理、檢索和鑒定

利用Masshunter工作站中的MFE軟件，通過設定合適的閾值參數，對升麻甲醇提取物正負離子模式下采集到的原始質譜數據進行分子特征提取，得到精簡的質譜數據信息。然后將精簡后的特征離子導入到自定義化合物數據庫中。該數據庫收集了文獻已報道升麻化學成分的化合物名稱、CAS號、分子式、精確質量數、化學結構式等相關信息，由PCDL軟件編輯而成。在數據庫中執行Batch Search（批處理檢索）操作，檢索得到可能與升麻相關的候選成分，接著根據質譜裂解規律，對二級質譜碎片進行解析，推測化合物的結構，并輔以部分標準品的確證，鑒定升麻甲醇提取物中的主要化學成分。

2 結果與分析

2.1 提取方法及色譜條件的選擇

提取方法的選擇：考察不同超聲時間，不同比例的甲醇溶液（40%、60%、80%、100%）的超聲提取效果，將色譜峰的數量和響應強度作為考察指標，最終確定提取時間為40 min，提取溶劑為80%甲醇溶液。

色譜柱的選擇：實驗比較了C18、HSS T3不同類型色譜填料，5、1.7 μm不同填料粒徑，50、100 mm色譜柱長度，4.6、2.1 mm色譜柱內徑的色譜分離情況，結果顯示Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱峰容量大、色譜分離效果最佳。

流動相的選擇：在色譜條件篩選過程中，實驗比較了乙腈溶液與甲醇溶液的分離效果，結果表明乙腈溶液的分離效果更好；繼而又對乙腈-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液的分離效果進行對比，結果表明當流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液時，色譜分離效果最好。

2.2 興安升麻化學成分色譜峰的鑒定

圖1 興安升麻UPLC-Q-TOF-MS正（A）、負（B）總離子流色譜圖Fig. 1 UPLC-Q-TOF-MS total ion current (TIC) chromatograms of chemical components from C. dahurica in positive and negative ion modes

依據供試品的色譜保留時間、碎片離子峰等信息，結合質譜裂解規律和部分標準品確證，從興安升麻甲醇提取物中共鑒定了38 個化合物，其中19 個于正離子模式下檢測，另19 個在負離子模式下檢測到，見圖1、表2。

2.3 化合物的MS解析

2.3.1 苯丙素類

鑒定苯丙素類化合物共18 個，其中苯丙素苷2 個、木質素1 個，咖啡酸類15 個，分別為表2中的化合物2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、17、20、21、22、23和24。

化合物4、5均失去一個氫離子得到母離子m/z 315.107 3 [M－H]－，在二級質譜中檢測到m/z 161、153 [M－H－162]－，保留時間分別為5.11 min和5.88 min，其裂解過程為準分子離子丟失一分子六元含氧糖生成苷元碎片離子。通過與自制的北升麻瑞、北升麻寧標準品對照，含半乳糖化合物出峰時間早于含葡萄糖的化合物，根據文獻[15-16]數據確定化合物4為北升麻瑞，化合物5為北升麻寧，均為苯丙素苷類化合物，裂解途徑如圖2A所示。

化合物1 1失去一個氫離子得到母離子m/z 521.204 2 [M－H]－，其保留時間為14.59 min，檢測到二級碎片離子m/z 359 [M－H－162]－、161，結合碎片離子質量推測其裂解過程為準分子離子m/z 521.204 2失去葡萄糖中性碎片，得到m/z 359、161的碎片離子峰，裂解途徑如圖2B所示，與(＋)-異落葉松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷標準品進行對照，確定化合物11為(＋)-異落葉松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是升麻屬中首次分離得到的木質素類化合物。

化合物7失去一個氫離子得到母離子m/z 179.035 3 [M－H]－，豐度較高，其保留時間為8.08 min，在二級質譜中檢測出m/z 135，根據文獻[17]推測其裂解途徑為準分子離子脫去一分子CO2得到碎片m/z 135 [MH－44]－，裂解途徑如圖2C所示，與咖啡酸對照品一致，確定化合物7為咖啡酸。

化合物8、12均失去一個氫離子得到母離子m/z 193.05 [M－H]－，二級質譜中均檢測到m/z 178、134的碎片離子，保留時間分別為12.96 min和14.61 min，因2 個成分質譜數據完全相同，所以互為同分異構體。根據文獻[18]推測其裂解途徑，為準分子離子丟失一分子CH3?，形成m/z 178的碎片離子，再失去一分子CO2，生成m/z 134 [M－H－15－44]－的碎片離子。通過與阿魏酸、異阿魏酸標準品進行對照，確定化合物8為阿魏酸，化合物12為異阿魏酸。阿魏酸的裂解途徑如圖2D所示，異阿魏酸的裂解規律與阿魏酸相似。

化合物9失去一個氫離子得到母離子m/z 609.144 3[M－H]－，其保留時間為13.23 min，特征碎片離子為m/z 253、178、163、134，根據文獻[14]推測其裂解途徑可能是m/z 609.144 3丟失一分子六元糖基碎片得到苷元碎片，苷元碎片再失去一分子咖啡酸及一分子H2O，得到m/z 253、178 [C9H8O4－H]－的碎片離子，碎片m/z 178分別失去一分子CH3?和一分子CO2，分別得到碎片m/z 163、134。根據文獻[14]數據推斷化合物9可能為咖啡酸類衍生物shomaside A。

表2 UPLC-Q-TOF-MS在正、負離子模式下鑒定興安升麻中化學成分Table 2 Compounds identi fi ed in C. dahurica by UPLC-Q-TOF-MS in both negative and positive ion modes

化合物13、14均失去一個氫離子得到母離子m/z 593.15 [M－H]－，二級質譜檢測出碎片離子均為m/z 253、178、163、134，保留時間分別為14.96 min和15.36 min，裂解途徑與shomaside A相似，推測二者母核相同但糖基種類不同，鑒于含半乳糖化合物出峰時間早于含葡萄糖的化合物，結合質譜數據推斷化合物13可能為shomaside B，化合物14可能為shomaside C。

化合物1 7失去一個氫離子得到母離子m/z 433.075 9 [M－H]－，其保留時間為16.60 min，在二級質譜中檢測出m/z 271、179、135碎片離子，根據參考文獻[14,20]推測其裂解途徑為m/z 433.075 9失去一分子咖啡酰氧基得到碎片m/z 271 [M－H－C9H7O3]－，碎片m/z 179 [C9H8O4－H]－失去一分子CO2得到m/z 135的碎片離子，根據文獻[14,20]推測化合物17可能為蜂斗菜酸。

化合物21、22均失去一個氫離子得到母離子m/z 447.092 4 [M－H]－，均檢測出二級碎片離子m/z 253、235、194，m/z 253碎片豐度峰較高，保留時間分別22.28 min和24.27 min。結合文獻[20]推測出準分子離子丟失一分子阿魏酸/異阿魏酸的中性碎片，得到m/z 253 [M－194]－碎片離子，碎片m/z 253進一步裂解丟失一分子H2O得到碎片m/z 235，依據文獻[20]質譜數據推斷化合物21可能為升麻酸A，化合物22可能為升麻酸B。

化合物23、24均失去一個氫離子得到母離子m/z 431.096 7 [M－H]－，二級質譜中檢測出m/z 237、193、165的碎片離子，保留時間分別25.66 min和26.83 min，裂解途徑與升麻酸A、升麻酸B相似。結合文獻[14]數據，2-阿魏酰基-番石榴酸的出峰時間早于2-異阿魏酰基-番石榴酸，推斷化合物23可能為2-阿魏酰基-番石榴酸，化合物24可能為2-異阿魏酸酰基-番石榴酸。

圖2 北升麻瑞、北升麻寧（A）、()-異落葉松脂素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）、咖啡酸（C）、阿魏酸（D）的裂解途徑Fig. 2 Fragmentation pathways of cimidahurine and cimidahurinine (A),(+)-isolariciresinol-3-O-β-D-glucopyranoside (B),caffeic acid (C), and ferulic acid (D)

2.3.2 含氮化合物

圖15所示為某型飛機叉耳式機身—機翼交點對接裝配示意圖，機身交點軸線faF的長度l1=800 mm，機翼交點軸線waF的長度l2=1 000 mm。基準A、基準B分別為機身、機翼的中心線。機身、機翼單獨制造時，機身交點軸線faF相對基準A的同軸度要求faT=0.1 mm，機翼交點軸線waF相對基準B的同軸度要求waT=0.2 mm。機身—機翼對接裝配時，waF相對faF的同軸度誤為協調控制對象。利用交點軸線T-Maps和累積T-Map的幾何關系進行公差累積分析，以獲的空間波動域。

鑒定含氮化合物共6 個，其中生物堿類2 個，酰胺類4 個。分別為表2中的化合物1、10、16、18、19和25。

化合物1結合一個氫離子得到母離子m/z 154.097 1[M＋H]＋，其保留時間為1.11 min，二級質譜中測定出m/z 112、95的碎片離子，根據文獻[13]以及碎片離子質量，推測其裂解途徑為準分子離子失去一分子碳二亞胺（NH＝C＝NH），得到碎片m/z 112 [M＋H－42]＋，碎片m/z 112進一步丟失一分子H2O得到碎片m/z 95，其裂解途徑如圖3A所示，根據文獻[13]數據推斷化合物1可能為cimipronidine型生物堿cyclocimipronidine。

化合物25結合一個氫離子得到母離子m/z 614.367 1[M＋H]＋，其保留時間為30.45 min，檢測到二級碎片離子為596，根據文獻[23-24]以及依據氮規則推斷出化合物為9,19-cycloane cycloartane型，含有一個氮原子，準分子離子失去一分子H2O得到碎片m/z 596 [M＋H－H2O]＋，此外，化合物還可與一個鈉離子結合得到m/z 636 [M＋Na]＋。根據文獻[23-24]數據推斷化合物25可能為升麻堿。

化合物1 0結合一個氫離子得到母離子m/z 492.185 3 [M＋H]＋，其保留時間為13.87 min，檢測到二級碎片離子m/z 330、177，根據文獻[13]以及依據氮規則推斷出化合物含有一個氮原子，推測其裂解過程為準分子離子丟失一分子糖基，得到碎片m/z 330 [M＋H－162]＋，R2位的糖基被H取代后，酰胺鍵斷裂，生成阿魏酸碎片，得到m/z 177的碎片離子。與自制的升麻酰胺A標準品進行對照，確定化合物10為升麻酰胺A。

化合物1 6結合一個氫離子得到母離子m/z 476.190 3 [M＋H]＋，其保留時間為16.15 min，二級質譜中檢測到m/z 314 [M＋H－162]＋、177的碎片離子，裂解途徑與升麻酰胺A相似，與自制的反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷標準品進行對照，結合文獻[13]數據確定化合物16為反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其裂解途徑如圖3B所示。

圖3 Cyclocimipronidine（A）、反式阿魏酰酪胺-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）、升麻酰胺（C）的裂解途徑Fig. 3 Fragmentation pathways of cyclocimipronidine (A), transferuloyl tyramine-4-O-β-D-glucopyranoside (B), and cimicifugamide (C)

化合物18、19均結合一個氫離子得到母離子m/z 506.202 3 [M＋H]＋，二級碎片離子均為m/z 344 [M＋H－162]＋、177，保留時間分別為17.71 min和18.06 min，裂解途徑與升麻酰胺A相似，兩者質譜數據相同，互為同分異構體，推測兩者的甲氧基與糖基的位置不同，根據文獻[21-22]異升麻酰胺的出峰時間早于升麻酰胺，推斷化合物18可能為異升麻酰胺，化合物19可能為升麻酰胺，其裂解途徑如圖3C所示。

2.3.3 色原酮類

圖4 升麻素的裂解途徑Fig. 4 Fragmentation pathways of cimifugin

2.3.4 皂苷類

鑒定皂苷類化合物共13 個。升麻屬最主要的成分是三萜皂苷，大多為同分異構體。分別為表2中的化合物26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38。

化合物2 6結合一個氫離子得到母離子m/z 637.393 7 [M＋H]＋，其保留時間為40.58 min，檢測到二級碎片離子m/z 487 [M＋H－150]＋，根據文獻[25]以及碎片離子質量，推測準分子離子失去一分子木吡喃糖得到碎片m/z 487，推測化合物26可能為12-β-羥基升麻醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物2 7失去一個氫離子得到母離子m/z 679.406 5 [M－H]－，其保留時間為40.61 min，二級質譜檢測到碎片m/z 619，根據文獻[26]及碎片離子質量，推測裂解途徑為準分子離子失去乙酰氧基碎片，得到m/z 619 [M－H－59]－的碎片離子，推斷出化合物27可能為hydroshengmanol型的24-O-乙酰氫化升麻新醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物28、29均失去一個氫離子得到母離子m/z 661.39 [M＋H]＋，檢測到二級碎片離子為m/z 643、601、583，保留時間分別為52.65 min和61.78 min，根據文獻[26-27]及碎片離子質量，推測準分子離子失去一分子H2O和一分子乙酰氧基碎片，得到m/z 643[M＋H－18]＋、601 [M＋H－59]＋及m/z 583 [M＋H－18－59]＋的碎片離子，并且23-epi-26-脫氧升麻烴出峰時間早于26-脫氧升麻烴，結合文獻數據推測化合物28可能為23-epi-26-脫氧升麻烴；化合物29可能為26-脫氧升麻烴，其裂解途徑如圖5A所示。

化合物31、32和33均失去一個氫離子得到母離子m/z 661.39 [M＋H]＋，二級離子碎片均為m/z 643、601、583，保留時間分別為66.99、67.11 min和78.39 min，裂解途徑與23-epi-26-脫氧升麻烴、26-脫氧升麻烴相似。結合文獻[25]與不同化合物的出峰時間對照，含阿拉伯糖苷的化合物出峰時間早于含木糖的化合物，推斷化合物31可能為25-O-乙酰-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷；化合物32可能為25-O-乙酰-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-α-L-木糖苷；化合物33可能為3’-O-乙酰-24-epi-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木糖苷。

化合物3 0結合一分子醋酸得到母離子m/z 665.389 1 [M＋HCOO]－，其保留時間為63.72 min，二級質譜中檢測到碎片離子m/z 647、619 [M－H]－、533，根據文獻[25]及碎片離子質量，推測化合物為cimigenol型皂苷，準分子離子失去一分子H2O，得到碎片m/z 647[M＋HCOO－H2O]－，或失去阿拉伯糖中性分子得到碎片m/z 533 [M＋HCOO－132]－，其裂解途徑如圖5B所示，推斷化合物30可能為升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物34、35均結合一個氫離子得到母離子m/z 619.384 6 [M＋H]＋，二級碎片離子均為m/z 601、487，保留時間不同，分別為78.87 min和79.09 min，根據文獻[26]及碎片離子質量，推測化合物均為cimigenol型皂苷，準分子離子失去一分子H2O，得到碎片m/z 601 [M＋H－H2O]＋，或失去木吡喃糖糖中性分子得到碎片m/z 487[M＋H－132]＋，7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷出峰時間早于24-epi-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷，與自制24-epi-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷標準品對照，確定化合物35為24-epi-7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷，結合文獻[26]數據推斷化合物34為7,8-雙去氫升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物3 6結合一個氫離子得到母離子m/z 621.397 9 [M＋H]＋，其保留時間為79.32 min，二級譜中碎片離子為 m/z 603、453，根據文獻[28]以及碎片離子質量，推測化合物為cimigenol型皂苷，準分子離子失去一分子H2O得到碎片m/z 603 [M＋H－H2O]＋，碎片m/z 603繼而失去木吡喃糖糖碎片得到m/z 453 [M＋H－H2O－150]＋，此外，化合物還可與一分子鈉離子結合得到m/z 643 [M＋Na]＋。與升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷標準品對照，確定化合物36為升麻酮醇-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物3 7結合一個氫離子得到母離子m/z 663.410 1 [M＋H]＋，其保留時間為84.84 min，二級譜測得碎片離子m/z 645，根據文獻[25]以及碎片離子質量，推測化合物為cimigenol型皂苷，準分子離子失去一分子H2O得到碎片m/z 645 [M＋H－H2O]＋，結合文獻[25]數據推斷化合物37可能為25-O-乙酰升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。

化合物3 8失去一個氫離子得到母離子m/z 619.383 5 [M－H]－，其保留時間為88.85 min，檢測到二級碎片離子m/z 601，通過碎片m/z 601推測裂解途徑為準分子離子失去一分子H2O，得到碎片m/z 601 [M－HH2O]－，此外，化合物還可與一分子醋酸離子形成加合離子m/z 665 [M＋HCOO]－。結合文獻[25]數據，推斷化合物38可能為升麻新醇木糖苷。

圖5 26-脫氧升麻烴（A）和升麻酮醇-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（B）的裂解途徑Fig. 5 Fragmentation pathways of 26-deoxyactein (A), and cimigenol-3-O-α-L-arabinoside (B)

3 結 論

實驗共鑒定了興安升麻中的38 種化學成分，其中包括18 個苯丙素類化合物，6 個含氮化合物，13 個皂苷類化合物以及1 個色原酮。以上成分中，苯丙素類具有抗腫瘤、抗HIV、抗氧化、抗炎、抗微生物、抗凝血等方面的生物活性，某些苯丙素還有降血脂、降血壓、降血糖、抗血栓、抗突變、抗早孕，抗毒蛇，鎮痛鎮靜等作用[29]；生物堿類具有抗炎、抗菌、擴張血管、強心、平喘、抗癌等作用[30]；皂苷類具有調節免疫能力、護腦護心、延緩衰老、抗腫瘤、擴張腦血管、增加血流量、抑制中樞神經和中樞鎮靜的作用，還能補氣生血[31]。興安升麻可治療圍絕經期綜合征，具有抗腫瘤、抗骨質疏松、抗炎、免疫抑制作用以及降糖作用等[32]，推測與上述成分的多種藥理活性協同發揮作用有關。綜上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技術，對興安升麻的甲醇提取物進行了多個成分的鑒定，可為后續進一步的化學物質基礎及質量控制和臨床應用提供一定的參考。