3 個品牌干腌火腿皮下脂肪揮發性風味比較分析

譚椰子，周光宏，徐幸蓮，劉 源，李春保,*，張丹妮*

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；3.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048）

風味是人們評定食品的重要指標之一[1]。干腌火腿風味在中華傳統特色肉制品中獨樹一幟，中國著名的3 大干腌火腿分別是金華火腿、宣威火腿與如皋火腿，也是中國產量及銷量多且廣受好評的腌臘肉制品[2-4]。干腌火腿的風味形成途徑[5]包括脂類的氧化降解[6]、蛋白質氨基酸的分解[7]、美拉德反應[6]、硫胺素降解和微生物作用等，其中脂質的氧化是最重要的形成途徑。近年來，對于干腌火腿揮發性風味的研究較為多見，如郇延軍等[8]通過對中西方的干腌火腿的風味成分比較為中國火腿的加工工藝的改進提供參考；Wang Wenli等[9]對金華、宣威和如皋火腿的揮發性風味進行全二維氣相色譜法分析并討論了揮發性成分形成的機制，認為火腿香氣在個體之間的差異來自于當地環境（如微生物菌群、溫度和相對濕度）及原料類型（如年齡和膳食）。但是，對于3 大干腌火腿皮下脂肪的揮發性風味的系統研究甚少，脂肪是干腌火腿揮發性風味的重要前體物質[5]，Tyra等[10]發現原料品種和年齡對火腿皮下脂肪含量有影響；Narváez-Rivas等[11-13]研究了火腿在腌制過程中皮下脂肪揮發性醇類和酯類的含量變化以及醛類和酮類的化學變化，并討論了將固相萃取與氣相色譜-氫火焰離子檢測器聯用方法應用于火腿皮下脂肪氧化產物的測定。崔瑩瑩[14]對宣威火腿加工過程中的脂質水解氧化對其風味形成的影響進行了研究；閆文杰[15]優化了金華火腿肌內脂肪和皮下脂肪的提取條件；彭聰等[16]研究了不同成熟時期宣威火腿的風味和營養。而本實驗以我國3 個品牌及其不同加工時長的火腿為例，系統地研究其皮下脂肪的揮發性風味物質，探討影響皮下脂肪風味的關鍵活性物質。

雖然脂肪是揮發性風味的重要前體物質[5]，但攝入過多的脂肪會影響人體健康，脂肪替代物[17]應運而生，研究火腿皮下脂肪的揮發性風味是脂肪替代物的研發的先決條件。本研究以不同加工時長的金華火腿、宣威火腿和如皋火腿的皮下脂肪為實驗材料，采用電子鼻、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯用方法，對皮下脂肪的揮發性風味物質進行相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），旨在研究并區分干腌火腿皮下脂肪的揮發性香味物質及其變化，以期為全面了解干腌火腿皮下脂肪風味構成及研制脂肪替代物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金華金字火腿、宣威浦記火腿及長壽如皋火腿1 a陳、2 a陳和3 a陳各8 條，分別購自浙江省金華市金字火腿有限公司、云南省宣威市浦記火腿食品有限公司以及江蘇長壽如皋火腿有限公司。樣品購置后放置于－20 ℃凍庫保存。

甲醇（色譜級）、3-甲基丁醛（GC標準品，純度≥99%）、正構烷烴（C8～C26） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SCIONSQ-456-GC GC-MS聯用儀 美國布魯克公司；SAAB-5731875 μm CAR/PDMS SPME萃取頭 上海安譜實驗科技股份有限公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsech公司；Fox4000電子鼻 法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

取干腌火腿股二頭肌整塊，剔除腿骨，取皮下脂肪，將處理好的樣品真空包裝，置于－20 ℃冰箱貯藏備用。實驗前將樣品在4 ℃過夜解凍，樣品解凍后，置放在潔凈的操作臺上切成1 cm3小塊，混合均勻后使用絞肉機將皮下脂肪絞碎。金華金字1 a陳、2 a陳、3 a陳，宣威浦記1 a陳、2 a陳、3 a陳，長壽如皋1 a陳、2 a陳和3 a陳火腿皮下脂肪分別縮寫為JH1、JH2、JH3、XW1、XW2、XW3、RG1、RG2和RG3。

1.3.2 電子鼻檢測

所用電子鼻共有18 根傳感器，分別為LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/Gctl、LY2/Gct、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1和TA/2，每根傳感器都有對應的敏感物質類型。將火腿脂肪絞碎，樣品放進10 mL的電子鼻專用瓶子并且密封，每個樣品為（1.00±0.01）g。可以將樣品放入4 ℃低溫操作間待檢。

電子鼻檢測條件根據宋雪[18]的方法稍作修改。電子鼻采集時間為120 s，數據采集周期為1.0 s，數據采集延遲600 s，流量150 mL/min，進樣量500 μL，孵化期400 s，孵化溫度60 ℃，清洗時間120 s，注射器溫度60 ℃，攪拌速率500 r/min，開始攪拌5 s，停止攪拌2 s。

1.3.3 SPME-GC-MS聯用技術分析

SPME條件：取5.0 g樣品置于20 mL頂空瓶中，對萃取頭進行老化，將老化后的萃取頭（75 μm CAR/PDMS）插入頂空瓶上部（避免接觸樣品），在50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

GC-MS參數參考郇延軍[19]和Petri?evi?a[20]等的方法并稍作修改。采用DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對揮發性風味物質進行分離，以高純氦氣（流速0.8 mL/min）為載氣，進樣口溫度為250 ℃，不分流，溶劑延遲為1.8 min。GC程序升溫條件如下：首先在40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至90 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持7 min。質譜條件如下：接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z 33～400。

1.4 數據分析

1.4.1 定性方法

選用C8～C26的正構烷烴，計算揮發性化合物的保留指數，其計算如式（1）所示：

式中：RI為保留指數；Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分別為待測揮發性成分、含n個碳原子正構烷烴及n＋1個碳原子正構烷烴的保留時間。揮發性化合物的定性結合保留指數和NIST2014和Wiley 8.0譜庫進行鑒定，僅報道正反匹配度均大于最大值的80%的結果。

1.4.2 定量方法

各種化合物的相對含量采用峰面積歸一化法計算。

1.4.3 主體風味評價方法

采用劉登勇等[21]的ROAV法對干腌火腿的主體風味成分進行評價，各化合物的ROAV按式（2）計算：

式中：ROAVi為某揮發性風味物質的相對氣味活度值；Ci為某揮發性風味物質的相對含量；Tstan為氣味貢獻最大揮發性風味物質的閾值；Cstan為氣味貢獻最大揮發性風味物質的相對含量；Ti為某揮發性成分的嗅覺閾值。

1.4.4 統計分析

所有揮發性化合物數據均采用SAS 9.2軟件進行數據統計，并進行方差分析和顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，數據均以表示。電子鼻數據結果經過Statistic 7軟件進行分析后采用OriginPro 2017繪制電子鼻PCA圖，并采用Excel作雷達圖，揮發性化合物PCA采用Canoco5軟件處理。

2 結果與分析

2.1 電子鼻數據分析

2.1.1 雷達圖

電子鼻中的18 根傳感器對樣品中一系列揮發性風味物質產生響應，可以表現為指紋信息[22]。

圖1 電子鼻檢測3 個品牌干腌火腿及3 個加工時長皮下脂肪香氣雷達圖Fig. 1 Radar plot of E-nose data for discrimination among different brands dry-cured hams of different ages in terms of volatile compounds of subcutaneous fat

如圖1所示，3 個品牌干腌火腿雖然原料、產地和加工工藝不盡相同，但同一加工時長火腿皮下脂肪的香氣輪廓更接近，這反映了加工時長的累積對干腌火腿揮發性風味的影響。3 種不同加工時長的火腿香味輪廓差異主要集中在P30/2、P30/1、PA/2、T70/2、LY2/Gctl、LY2/GH、LY2/AA、LY2/G這8 根傳感器上，表明其對不同種火腿及加工時長的皮下脂肪香氣輪廓的區分效果較好。根據喻勇新等[23]的研究可知，這8 根傳感器的敏感物質類型包括酮類、碳氫化合物、胺類化合物、二甲苯、碳氧化合物等，導致不同加工時長下3 個品牌火腿的皮下脂肪香氣輪廓的差異。

2.1.2 PCA結果

圖2 3 個品牌火腿及不同加工時長皮下脂肪電子鼻數據的PCA載荷圖Fig. 2 PCA loadings plot of E-nose data for volatile compounds in subcutaneous fat of three brands of dry-cured hams of different ages

電子鼻設備自帶的PCA軟件可以將18 根傳感器采集的數據進行轉換和降維，得出的空間分布圖可以更好地反映指標信息[24]。如圖2所示，判別指數為81，區分度較高，PC1貢獻率為96.20%，PC2貢獻率為2.30%，貢獻率總和為98.50%，大于95%，說明PCA方法適用于3 個品牌干腌火腿皮下脂肪揮發性成分分析，這兩個主成分可以代表樣品揮發性成分的主要特征。通過比較各組樣品的橫縱坐標發現，金華金字火腿的3 個加工時長的皮下脂肪的揮發性風味較為接近；XW3揮發性成分在PC1與其他2 個加工時長差異明顯，3 種加工時長的長壽如皋火腿皮下脂肪揮發性成分在PC1差異明顯。此外，XW3與RG3揮發性風味在PC1中較為接近，二者均為3 a陳火腿皮下脂肪，可能是加工時長對香氣和風味特征的影響較大，成熟的火腿顯示出較高的風味強度[25]。電子鼻研究結果表明：利用PCA能很好地區分不同品牌和加工時長的干腌火腿皮下脂肪的揮發性風味。

2.2 SPME-GC-MS檢測結果

與電子鼻檢測的香氣指紋相比，GC-MS可以對大量揮發性化合物進行分析。SPME萃取頭可以在一定的溫度下將樣品中的揮發性化合物吸附提取，并在特定的溫度下進行釋放，經過GC-MS的升溫程序將不同的揮發性化合物區分出來，生成總離子流圖，再比對GC-MS自帶的譜庫，將大量的揮發性化合物鑒定出來[26]。

2.2.1 SPME-GC-MS檢測揮發性風味物質

采用SPME-GC-MS方法，檢測3 個加工時長的金華金字、宣威浦記和長壽如皋火腿皮下脂肪的揮發性風味物質。由表1可知，從金華金字火腿皮下脂肪中檢測出56 種風味化合物，包括15 種醛類、8 種酮類、9 種醇類、1 種芳香烴類、8 種酯類、3 種呋喃類、8 種酸類、1 種烴類和3 種其他類。從宣威浦記火腿皮下脂肪中共鑒定得到53 種風味化合物，包括 15 種醛類、7 種酮類、12 種醇類、2 種芳香烴類、5 種酯類、2 種呋喃類、7 種酸類、1 種烴類和2 種其他類。從長壽如皋火腿的皮下脂肪中共鑒定得到57 種風味化合物：包括15 種醛類、8 種酮類、11 種醇類、1 種芳香烴、6 種酯類、3 種呋喃類、8 種酸類、2 種烴類和3 種其他類。3 個品牌干腌火腿皮下脂肪的揮發性風味物質共有62 種，其中醛類16 種、酮類8 種、醇類12 種、芳香烴2 種、酯類8 種、呋喃類3 種、酸類8 種、烴類2 種和其他類3 種。

2.2.2 GC-MS定量結果

如表1所示，各品牌的揮發性化合物的種類和含量都有較大的區別。不同品牌及不同加工時長的干腌火腿皮下脂肪共有的揮發性風味物質包括醛類（3-甲基丁醛、正戊醛、己醛、庚醛、2-己烯醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛、2,4-己二烯醛、(Z)-2-辛烯醛）、酮類（3-辛烯-2-酮）、醇類（1-戊烯-3-醇、戊醇、3-戊醇和1-己醇）、呋喃類（2-乙基呋喃和2-正戊基呋喃）、酸類（2,2-二甲基丙酸、丁酸和己酸）。其中，2-壬烯醛和γ-戊內酯是金華品牌樣品與其他品牌樣品之間差異的主要成分，辛醇和1,2-二甲苯是宣威品牌樣品與其他樣品之間差異的主要成分，十二烷是如皋品牌樣品與其他樣品之間差異的主要成分。

1 a陳、2 a陳和3 a陳的火腿代表不同加工時長的干腌火腿，如表1所示，火腿的揮發性化合物含量隨著加工時長的增加發生了顯著變化。產生這些差異的原因可能是溫度和水分活度的變化導致火腿皮下脂肪氧化程度的差異[27]，這一點與電子鼻數據結果吻合。正戊醛、苯甲醛、3-甲基-1-丁醇、戊醇、1-己醇、γ-戊內酯、乙酸、丁酸和戊酸含量在金華品牌的3 個加工時長中差異顯著，可作為金華金字品牌加工時長評判的依據；同理，戊醇、1-己醇、辛醇和十六酸甲酯，可作為宣威浦記品牌加工時長評判的依據；(E)-2-庚烯醛、(Z)-2-辛烯醛、3-辛烯-2-酮和丁酸可作為長壽如皋品牌加工時長評判的依據。

金華金字火腿、宣威浦記火腿與長壽如皋火腿這3 大干腌火腿不僅原料不同，而且產地和加工工藝也不相同，形成了干腌火腿皮下脂肪的不同揮發性風味。目前，金華火腿與宣威火腿的生產工藝已有國家推薦標準，它們屬于地理標志產品，如皋火腿暫無相關標準。干腌火腿的加工工藝中的用鹽量及腌制時間各不相同，除此之外，氣候條件的差異不容忽視。傳統金華火腿依賴自然條件生產[28]，其產地年平均氣溫17.4 ℃，相對濕度77%[29]；而如皋火腿加工季節是從農歷11月至次年2月[4]；宣威火腿腌制最佳時間是當年霜降到次年立春之前[30]。與浙江的金華火腿和江蘇的如皋火腿相比較，云南的宣威火腿其加工環境的氣候條件更適宜火腿腌制，云南省緯度更低，其產地年平均溫度13.3 ℃，平均相對濕度72%[30-31]，可加速火腿皮下脂肪的水解和轉化，從而產生揮發性小分子，形成揮發性風味[32]。值得關注的是，近年來我國傳統干腌火腿的原料、工藝和氣候環境都發生了一定變化。1 a陳、2 a陳和3 a陳的干腌火腿揮發性風味有差異，皮下脂肪中的大部分脂肪酸氧化產物如醛類、酮類和醇類含量隨加工時長增加發生了不同變化，反映了在加工時長的累積下，皮下脂肪的氧化程度加深[33]。此外，通過對比先前火腿風味的相關研究[18,34-35]，發現皮下脂肪中很多揮發性風味物質是干腌火腿總體風味中的重要組成成分。

2.3 ROAV鑒定關鍵性風味物質

干腌火腿皮下脂肪的揮發性風味是由各揮發性化合物的嗅覺閾值與其在風味體系中的濃度共同決定的，為進一步確定干腌火腿皮下脂肪的關鍵性風味物質，結合表1所示的所有化合物的含量和嗅覺閾值，確定各揮發性化合物的ROAV如表2所示。ROAV可以根據定量的數據和嗅覺閾值提供一種更好的評估方法[36]，它在一定程度上衡量出了在眾多的揮發性風味活性物質中對整體風味有重要貢獻的物質，ROAV越大，對揮發性風味的貢獻越大。在3 個品牌干腌火腿皮下脂肪揮發性風味物質中，己醛含量最多，且閾值只有5 μg/kg，以己醛作為基準物來計算其他揮發性化合物的ROAV，己醛的ROAV為100。表2中共有10 種醛類、1 種酮類、1 種醇類、1 種酯類和2 種呋喃類化合物，它們的ROAV均大于1，對火腿皮下脂肪的揮發性風味有重要貢獻。值得注意的是，醛類物質對干腌火腿皮下脂肪的整體風味貢獻極大；2-正戊基呋喃和2-乙基呋喃這兩種呋喃類物質，對理想香氣有重要貢獻。

表1 不同加工時長的金華金字、宣威浦記和長壽如皋火腿皮下脂肪香味物質相對含量分析Table 1 Volatile compounds of subcutaneous fat samples from Jinhua, Xuanwei and Rugao hams of different ages

續表1

表2 3 個品牌干腌火腿（3 個加工時長）皮下脂肪香味物質ROAV分析Table 2 ROAVs of volatile compounds in subcutaneous fat from three brands of Chinese hams of different ages

2.4 關鍵揮發性化合物PCA

為進一步研究不同產地及加工時長對干腌火腿皮下脂肪特征風味的影響，根據ROAV選取的15 種對干腌火腿皮下脂肪揮發性風味有貢獻（ROAV＞1）的揮發性化合物進行PCA（圖3），在這些揮發性化合物中，己醛具有草本香味，庚醛具有果香味，是脂肪分解自動氧化的副產物[38]。不飽和烯醛如(E)-2-庚烯醛和(Z)-2-辛烯醛等是多不飽和脂肪酸氧化的產物。1-辛烯-3-酮雖然含量低，但其氣味閾值只有0.005 μg/kg[37]，ROAV可以達到100以上，可能是不飽和脂質降解產物[39]。這些重要的揮發性化合物以不同的含量比例形成了各具特色的品牌火腿風味。

圖3 干腌火腿皮下脂肪及主要揮發性風味成分主成分雙標圖Fig. 3 PCA biplot for three brands of dry-cured ham in terms of selected volatile compounds in subcutaneous fat

雙標分析是一種科學的映射方法，它反映了一系列元素的二維表示及這些元素之間的關系[40]。對經過ROAV分析出的9 種火腿樣品的15 種揮發性化合物進行PCA，前兩個主成分貢獻的總方差為88.01%，PC1貢獻的方差為67.82%，PC2貢獻的方差為20.19%。在PC1上，JH1和RG3樣品的得分最高，均為正值，JH2和JH3正得分僅次于前兩者，而XW1、XW2、XW3、RG1和RG2這幾類樣品的PC1得分都為負值，3-甲基丁醛在PC1上的載荷最大，明顯能將JH1和RG3從其他樣品中區分開來，而相對較小的2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛在PC1的載荷能把JH2和JH3區分開來，其他11 種揮發性化合物在PC1的載荷為負，因此這些物質可以區分XW1、XW2、XW3、RG1和RG2這幾類樣品。其次，在PC2上，JH2和JH3得分為正，再次說明了2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛的載荷將其與其他樣品區分，RG3負得分最高，順-6-壬烯醛在PC2上的載荷可以將其與其他樣品區分。

從整體上看，通過對雙標圖信息的分析，部分樣品可以分別從這兩個主成分進行區分，但是有些樣品只能通過PC1或者PC2進行區分。這充分體現了雙標圖的優勢[41]。

3 結 論

本實驗對3 個品牌干腌火腿的皮下脂肪揮發性風味進行鑒定、分析和區分。基于電子鼻技術可實現對干腌火腿品種和加工時長的快速區分。基于SPME-GC-MS技術分析鑒定出62 種皮下脂肪的揮發性風味物質，結合ROAV篩選出的15 種揮發性風味活性物質，3-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、壬醛、(Z)-2-辛烯醛、2-壬烯醛、6-壬烯醛、(Z,Z)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁酸乙酯、2-正戊基呋喃和2-乙基呋喃，它們被鑒定為干腌火腿皮下脂肪中的關鍵氣味活性物質。通過PCA進一步證實了這15 種揮發性風味活性物質可以區分特定火腿皮下脂肪的揮發性風味，其中，3-甲基丁醛能將JH1和RG3與其他樣品進行區分，2-甲基丁酸乙酯和2-壬烯醛能區別JH2與JH3，其他11 種揮發性化合物可以區分XW1、XW2、XW3、RG1和RG2。研究結果將為干腌火腿特征揮發性風味物質形成機理的研究以及對研制干腌火腿脂肪替代物提供理論支撐。