高效液相色譜法同時測定棉籽油中游離棉酚及其降解產物四甲氧基棉酚含量

周夢宇，古麗斯坦·阿不來提，姚 軍*，陳 玲

（新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011）

新疆地區是我國優質的棉產區，棉花副產物之一的棉籽大部分用于榨油，并且棉籽油含有較高的不飽和脂肪酸[1-2]，可有效降低膽固醇和預防心腦血管疾病[3-4]。棉酚作為棉籽中提取的小分子化合物，是一種黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，在棉籽中含量高達0.15%～1.8%[5]。棉酚包含游離棉酚和結合棉酚兩種存在方式，其中結合棉酚是通過游離棉酚與賴氨酸中游離ε-氨基之間的共價鍵經褐變反應結合產生的，通常毒性較小[6]；而高濃度的游離棉酚會引起動物急性中毒，并伴有呼吸窘迫，厭食虛弱，甚至死亡等癥狀[7-9]，攝食游離棉酚1～3 個月后會造成毒性作用的積累效應[10-12]，有明顯的生殖毒性[13-16]，因此長期食用含有游離棉酚的棉籽油會引起慢性中毒[17]。游離棉酚由于結構中具有多個酚羥基及醛基，化學性質非常不穩定[18-19]，棉籽油中游離棉酚在室溫下放置30 d，80%的棉酚會發生降解[20]，在放置過程中，游離棉酚酚羥基中的H易發生甲基化反應（結構變化見圖1），根據本課題組研究發現證實游離棉酚在棉籽油中降解產物為四甲氧基棉酚[21]，并發現四甲氧基棉酚能夠對小鼠GC-2精母細胞造成生長抑制等毒性作用并導致細胞死亡[22]，造成雄性小鼠精子發生畸形變化，表明四甲氧基棉酚存在一定生殖毒性[23]；對SD大鼠灌服四甲氧基棉酚30 d后結果發現大鼠肝臟組織的形態結構改變，造成肝損傷，證實了四甲氧基棉酚的毒性作用[24]。

圖1 游離棉酚與四甲氧基棉酚結構變化圖Fig. 1 Structural changes of free gossypol relative to tetramethoxy gossypol

目前食用粗制棉籽油中毒的現象仍然存在[25]，而市售棉籽油中生產加工過程及隨著存放時間和環境的改變，游離棉酚及降解產物四甲氧基棉酚的存在是危害消費者健康的重要因素。GB 2716—2005《食用植物油衛生標準》[26]中規定食用植物油中棉籽油游離棉酚含量不得超過0.02%，然而對其降解產物四甲氧基棉酚的含量未作出規定，因而急需建立含量測定方法，因此本實驗建立了同時測定棉籽油中游離棉酚及其降解產物四甲氧基棉酚含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，并進行方法學考察，旨在建立更加科學的棉籽油質量控制方法，防止游離棉酚及四甲氧基棉酚含量不合格的食用棉籽油進入市場，對人民身體健康的保障起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棉酚標準品（純度98%）購自陜西慈源生物科技有限公司；四甲氧基棉酚工作標樣（純度85.30%）為課題組經ODS柱層析分離得到；實驗所檢測的1#～90#批市售棉籽油樣品來自新疆各地州大型油脂企業。

冰醋酸（分析純） 天津博迪化工股份有限公司；95%乙醇（分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；磷酸（優級純）成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

TB-114型分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；TDL-5A型離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；MS3BS25型渦旋振蕩器 德國IKA公司；1220型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil?ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇-2%磷酸（85∶15，V/V）溶液，進樣量10 mL，流速1.0 mL/min，柱溫32 ℃，檢測波長235 nm。

1.3.2 標準品溶液的制備

分別稱取6.13 mg棉酚標準品與10.56 mg四甲氧基棉酚工作標樣于25 mL容量瓶中，加入0.5 mL冰醋酸溶液，95%乙醇溶液溶解并定容至刻度，即為棉酚（0.245 mg/mL）及四甲氧基棉酚（0.422 mg/mL）的標準品溶液。精密吸取各1 mL標準品溶液，用95%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶中，得質量濃度為2.452 mg/mL的棉酚和4.224 mg/mL的四甲氧基棉酚混合標準品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密量取市售油樣2 mL，加入95%乙醇溶液2 mL，劇烈振搖2 min后靜置分層，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液即得含油樣的供試品溶液。

1.4 數據處理

各實驗至少重復3 次以上，使用CDS、Excel等軟件進行圖表的繪制和相關數據的統計處理。

2 結果與分析

2.1 棉酚及四甲氧基棉酚標準曲線的建立

精密吸取混合儲備液各0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察四甲氧基棉酚線性關系；精密吸取混合標準品溶液各1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察棉酚線性關系。各樣品經0.22 mm微孔濾膜過濾，按1.3.1節色譜條件進樣測定，記錄峰面積，HPLC見圖2。結果表明四甲氧基棉酚在0.211～1.056 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好，得線性回歸方程為：Y=2 205 265.15X－135 755.00，r=0.999 6；棉酚在0.245～1.226 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好，得線性回歸方程為：Y=1 809 717.37X－258 173.90，r=0.999 5。

圖2 四甲氧基棉酚（A）和棉酚（B）標準品HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of tetramethoxy gossypol (A) and gossypol (B) standards

2.2 精密度實驗

取經稀釋的同一份混合標準品溶液（棉酚質量濃度為0.736 mg/mL，四甲氧基棉酚質量濃度為0.636 mg/mL），經0.22 mm微孔濾膜過濾，按1.3.1節色譜條件進樣測定，連續進樣6 次，測得四甲氧基棉酚峰面積值為1 280 614、1 294 758、1 308 224、1 259 180、1 315 379、1 289 456 ，計算得相對標準偏差為1.56%；測得棉酚峰面積值為1 105 268、1 080 236、1 095 491、1 102 300、1 090 330、1 103 457，計算得相對標準偏差為0.88%，表明該方法精密度良好。

2.3 重復性實驗

精密量取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油樣品6 份于離心試管中，按1.3.3節方法操作，經0.22 mm微孔濾膜過濾，按1.3.1節色譜條件進樣檢測，測得四甲氧基棉酚峰面積值為1 489 375、1 493 646、1 505 442、1 486 409、1 458 576、1 472 375，計算得相對標準偏差為1.11%；測得棉酚峰面積值為1 330 995、1 277 432、1 308 919、1 298 049、1 329 467、1 283 157，計算得相對標準偏差為1.73%，表明該方法的重復性良好。

2.4 穩定性實驗

取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油樣品于離心試管中，按1.3.3節方法操作，在4 ℃放置0、2、4、6、8、10，12 h，經0.22 mm微孔濾膜過濾，按1.3.1節色譜條件進樣檢測，測得四甲氧基棉酚峰面積值為2 507 353、2 492 601、2 472 286、2 488 623、2 600 460、2 519 553，計算得相對標準偏差為1.81%；測得棉酚峰面積為1 583 502、1 638 809、1 553 259、1 576 115、1 608 310、1 596 012，計算得相對標準偏差為1.65%，表明棉籽油樣品中四甲氧棉酚及棉酚在12 h內穩定性良好。

2.5 加樣回收率實驗

吸取同一批含有四甲氧基棉酚（0.562 mg/mL）及棉酚（0.719 mg/mL）的棉籽油樣9 份各0.50 mL，3 份為一組，取四甲氧基棉酚質量濃度為0.636 mg/mL和棉酚質量濃度為0.837 mg/mL的混合標準品溶液分別加入0.35、0.45、0.55 mL，按1.3.3節方法操作，經0.22 mm微孔濾膜過濾，按1.3.1節色譜條件進樣檢測，四甲氧基棉酚平均回收率100.3%，相對標準偏差為1.12%；棉酚平均回收率為101.2%，相對標準偏差為1.75%（表1、2）。

表1 四甲氧基棉酚加樣回收率Table 1 Recoveries of tetramethoxy gossypol from spiked sample

表2 棉酚加樣回收率Table 2 Recoveries of gossypol from spiked sample

2.6 市售棉籽油四甲氧基棉酚及棉酚含量測定

1#～90#市售棉籽油樣品均按1.3.3節方法操作，按1.3.1節色譜條件進樣檢測。研究表明，90 批市售棉籽油有25 批檢測到棉酚，質量濃度為0.159～1.661 mg/mL，有56 批檢測到四甲氧基棉酚，質量濃度為0.093～1.661 mg/mL，結果見表3，市售棉籽油樣品與混合標準品溶液的HPLC對比圖見圖3。

表3 市售棉籽油樣品中四甲氧基棉酚及棉酚質量濃度Table 3 Contents of tetramethoxy gossypol and gossypol in commercially available cottonseed oil samples

續表3

圖3 混合標準品（A）與市售棉籽油（B）HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and commercially available cottonseed oil (B)

3 結論與討論

本研究使用的四甲氧基棉酚工作標樣，是課題組經ODS柱分離純化自制未脫毒棉籽油中的游離棉酚降解產物，采用HPLC檢測，根據面積歸一化法，得純度為85.30%的四甲氧基棉酚[24]，因未達到標準品純度范圍標準，所以僅作為工作標樣來進行研究考察。目前對于游離棉酚的檢測方法有很多，包括分光光度法[27]、高效薄層色譜法[28]、高效毛細管電泳法[29]、HPLC法[30]等。本實驗建立了HPLC法同時測定棉籽油中游離棉酚及降解產物四甲氧基棉酚含量的方法，該方法準確度高，精密度和靈敏度均能滿足測定要求，可以監管棉籽油生產企業的脫毒工藝，為棉籽油中游離棉酚及其降解產物四甲氧基棉酚的檢測標準奠定基礎，同時制止游離棉酚及降解產物含量超標的棉籽油進入市場，為本地區食品安全問題提供重要依據。

通過對新疆各地區市售棉籽油進行抽查，結果發現90 批市售棉籽油中有25 批檢測到游離棉酚，56 批檢測到四甲氧基棉酚，根據GB 2716—2005《食用植物油衛生標準》，檢測到市售棉籽油中游離棉酚及降解產物四甲氧基棉酚含量較低，且均低于國家標準，可能不足以對消費者的健康造成威脅，表明所檢測的新疆各地大型油脂企業棉籽油樣品，脫毒較完全，安全性較高。課題組后期將對新疆各地榨油小作坊的棉籽油樣品進行實地采集及檢測，用于更加全面地評價新疆市售棉籽油的脫毒情況及安全性。