基于特征肽段的阿膠中異源性物種鑒別

房 芳，張九凱，馬雪婷，蘇 敏，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.烏魯木齊海關，新疆 烏魯木齊 830063）

阿膠是一種由哺乳綱奇蹄目馬科動物驢的皮為主要原料熬制而成的膠類藥材[1]，具有補血滋陰、潤燥止血、增強人體免疫力等功效[2-4]，與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”[5]。由于驢皮原料不足，價格昂貴，一些不法商人受經濟利益驅使，在阿膠生產過程中摻入低價膠類藥材，如新阿膠（豬皮源）、黃明膠（牛皮源），非法謀利的情況屢見不鮮[6]，除此以外，使用其他性狀相似的哺乳動物皮類（如馬皮）投料違法生產的現象也時有發生[7]，致使市場上阿膠藥材摻假、摻雜現象嚴重，市場秩序混亂。

傳統的物種鑒別技術主要以酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[8]和以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）為基礎的核酸檢測方法[9-13]為主。基于蛋白水平的ELISA技術操作簡單，檢測成本低，可同時檢測大量樣品，但是該方法一次只能檢測單個蛋白質，不能同時檢測多個物種，反映特異性也不好，假陽性較高[14]。核酸檢測方法特異性強、靈敏度高，結果準確，是動物源性產品物種鑒別的主流方法[15-17]，但由于阿膠為深度加工產品，在長時間高溫熬煮過程中，DNA破壞嚴重[18]，限制了核酸技術在阿膠摻假物物種鑒別的應用。阿膠中的主要成分是驢皮膠原蛋白高溫不完全水解后的肽段，從分子遺傳學角度研究，由于不同物種DNA序列不同，其表達的氨基酸序列必然存在差異，使得不同來源蛋白酶切生成的肽段具有一定的特異性。利用靈敏度高、重復性好的質譜技術對不同物種間特征肽進行分析和測定[19-22]，為阿膠的物種鑒別提供了新的途徑。

近年來，以質譜為核心技術的鳥槍蛋白組學方法在物種鑒別領域得到了廣泛應用，該技術將蛋白質混合物酶解成肽段混合物，并利用色譜及質譜對具有物種特異性的特征肽段進行分析、鑒定，從而達到物種鑒別的目的[23-26]。與傳統方法相比，肽段穩定性更高，受生產加工方式的影響也相對較小。因此，本研究針對阿膠中摻入低價膠類藥材，如新阿膠（豬皮膠）、黃明膠（牛皮膠）和近緣膠（馬皮膠）的現象，采用鳥槍蛋白組學方法，通過比對驢和豬、牛、馬的蛋白酶解后的肽段序列，以期從肽段層面實現阿膠中異源性物種來源的鑒定，并為其他動物源性食品或藥材的物種鑒定提供理論指導和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠（n=3）、黃明膠（n=3）、新阿膠（n=2）、馬皮膠（按藥用阿膠工藝制得，n=2）、生驢皮（n=2）、生牛皮（n=2）、生豬皮（n=2）、生馬皮（n=2）北京同仁堂公司；阿膠對照藥材 中國食品藥品檢定研究院；96孔板 美國Thermo公司；濾紙 美國Whatman公司。

乙腈（色譜級） 德國CNW公司；甲酸 美國Sigma公司；去離子水 Milli-Q純水系統；胰蛋白酶美國Thermo Fisher-Pierce公司；尿素（蛋白質組學級）美國Promega公司；硫脲 美國Americo公司；考馬斯亮藍G250 北京克爾慧公司；牛血清蛋白 美國Sigma公司；碳酸氫鈉（純度99%） 中國醫藥集團。

蛋白質提取液：含有7 mol/mL尿素和2 mol/mL硫脲。稱取210.2 g尿素，76.12 g硫脲在常溫下用去離子水溶解并定容至500 mL（溶液溫度控制在37 ℃以下）。

牛血清蛋白標準溶液：稱取0.01 g牛血清蛋白置于10 mL容量瓶中，用 0.15 mol/L NaCl溶液定容至10 mL，室溫下充分混合溶解1 h，10 000 r/min離心。

1.2 儀器與設備

LC-20AD XR高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；TripleTOF?5600質譜儀、QTRAP?5500質譜儀美國AB SCIEX公司；Chrom XP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 nm）、Multiskan GO型酶標儀 美國Thermo Scientific公司；BEH C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm，300 nm） 美國Waters公司；TissueLyser II型組織研磨儀 德國QIAGEN公司；ME403E型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Concentrator plus型真空濃縮儀、Centrifuge 5418R型離心機 德國Eppendorf公司；SB5200D型超聲清洗儀寧波新芝生物科技股份有限公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國Scientific Industries公司；HH-1型數顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取與含量測定

取約2 g樣品制成粉末，稱取0.50 g皮膠粉末，加入5 mL蛋白提取液，離心后測定上清液中蛋白含量，取約含200 μg蛋白的上清液并轉移到超濾管中，12 000 r/min離心10 min，加入100 μL 50 mmol/mL碳酸氫銨溶液，12 000 r/min離心10 min，重復3 次，加入100 μL含有胰蛋白酶的50 mmol/mL碳酸氫銨溶液振蕩混勻，37 ℃酶解4 h（膠原蛋白因不含半胱氨酸而未涉及烷基化處理）。將下層超濾離心管取下放入冷凍干燥機中旋干濾液，加入去離子水，12 000 r/min離心10 min，重復3 次，最后加入100 μL 2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液定容。

Bradford法測定蛋白含量：1）標準曲線配制：分別移取0、20、40、50、60、80、100 μL 1 mg/mL牛血清蛋白標準溶液于1.5 mL EP管中，加入相應體積尿素-硫脲液補足100 μL。配制成標準曲線系列濃度：0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL。2）樣品溶液稀釋：分別將樣品上清液稀釋合適倍數，混勻備用。3）分別取各系列濃度溶液及樣品稀釋液30 μL，加入1 mL考馬斯亮藍染料，混合均勻。4）分別取300 μL系列標準溶液及樣品稀釋液的混合液加入96 孔板樣品孔中，595 nm波長處測定吸光度建立標準曲線，并測定樣品，計算相應蛋白含量。

1.3.2 檢測條件

1.3.2.1 納升高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（nano high performance liquid chromatography-quadrupoles time of fl ight-mass spectrometer，Nano-HPLC-QTOF-MS）條件

在線Nano-HPLC條件：色譜柱：Chrom XP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm）；上樣流速2 μL/min；時間10 min；柱溫40 ℃；流動相A為2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流動相B為98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流速0.3 μL/min；進樣體積4 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，5%～9% B；0.1～30 min，9%～25% B；30～40 min，25%～35% B；40～45 min，35%～80% B；45～50 min，80% B；50～51 min，5% B；51～60 min，5% B。

AB SCIEX Triple TOF?5600 QTOF-MS條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式；噴霧電壓：2.4 kV；霧化氣：41.4 kPa；氣簾氣：207 kPa；質譜掃描模式：信息依賴型采集工作模式；TOF MS模式：m/z350～1 500，250 ms；IDA TOF MS/MS模式：m/z100～1 500，30 MS/MS，100 ms，IDA閾值：120 cps，母離子電荷選擇范圍為＋2～＋5；Rolling CE：enabled；動態排除時間：20 s；運行時間：60 min。

1.3.2.2 高效液相色譜和三重四極桿質譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動相A為2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流動相B為98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～0.1 min，2% B；0.1～0.5 min，2%～8% B；0.5～25 min，8%～22% B；25～31 min，22%～35% B；31～33 min，35%～80% B；33～36 min，80% B；36～36.5 min，80%～2% B；36.5～39.9 min，2% B。

AB QTRAP?5500質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描參數：氣簾氣（CUR）2.76×105Pa，碰撞氣（CAD）Medium，IS電壓5 500 V，離子源溫度600 ℃，霧化器（GAS1）414 kPa，輔助氣（GAS2）414 kPa；正離子掃描Scheduled多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式：MRM檢測窗口60 s；掃描時間3 s。

1.3.3 特征肽段的檢測與驗證鑒定

以奇蹄目（Perissodactyla）、偶蹄目（Artiodactyla）為關鍵詞，在Uniprot數據庫檢索相關蛋白數據庫并導入ProteinPilot 5.0軟件進行蛋白質的鑒定，參數設定如下：Sample Type：Identification；Cys Alkylation：Iodoacetic acid；Digestion：Trypsin；Search Effort：Rapid ID；ID Focus：Biological modifications；FASTA：Sesamum indicum（Uniprot）。選取響應高、得分＞20、氨基酸個數6～20、可信度＞95%、無漏切的肽段作為預選特征肽段。

利用Skyline軟件構建馬皮特征肽MRM離子對，將特征肽段轉化為三重四級桿串聯質譜能夠識別的離子對信息。同時對離子對的碰撞能量和駐留時間進行優化。

2 結果與分析

2.1 阿膠及摻假膠蛋白鑒定

通過Nano-HPLC-QTOF-MS分別對阿膠、新阿膠、黃明膠和馬皮膠樣品進行鑒定，并采用ProteinPilot軟件進行數據處理（表1）。結果顯示，阿膠、新阿膠和黃明膠鑒定到豐度最高、有效肽段總數最多的蛋白分別為驢源、豬源、牛源的I型膠原蛋白α1鏈，而馬皮膠豐度最高的蛋白為驢源I型膠原蛋白α1鏈，說明驢和馬的膠原蛋白有很強的親緣性，此外在馬皮膠的鑒定結果中并沒有找到與馬源I型膠原蛋白α1鏈具有較高的匹配度的蛋白。I型膠原蛋白是動物源性皮類膠原蛋白重要組成，約占膠原蛋白總量的80%～90%，陸生哺乳動物I型膠原蛋白主要分為α1、α2兩種亞型[27]。除膠原蛋白以外，還鑒定到核層蛋白、肌球蛋白、角蛋白、血影蛋白等，僅在阿膠樣品中檢測到血紅蛋白。

表1 高分辨質譜鑒定結果統計Table 1 Results of identi fi cation of donkey-hide gelatin and animal glues by high-resolution mass spectrometry

2.2 不同物種來源膠類特征肽段檢測結果

由于阿膠、新阿膠、黃明膠樣品溶液鑒定到豐度最高的蛋白分別為驢源、豬源、牛源的I型膠原蛋白α1鏈，且馬皮膠豐度最高的蛋白也為驢源I型膠原蛋白α1鏈。因此，利用GENtle軟件對驢、豬、牛的I型α1膠原蛋白序列進行多序列比對，通過模擬胰蛋白酶酶切分別獲得3 種膠原蛋白的理論特征肽段。采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀MRM方法對3 種膠原蛋白的理論特征肽進行了驗證，證實了4 條理論特征肽的存在，受試的驢皮膠（含阿膠對照藥材）及生驢皮、新阿膠及生豬皮、黃明膠及生牛皮的酶解溶液中均驗證到各自物種的特征肽段，而不同物種樣品間各特征肽互不檢出。馬皮膠、生馬皮的酶解溶液中驗證到驢的特征肽段（表2）。

表2 特異肽段的MRM參數Table 2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for specific peptides

2.3 驢、豬和牛來源膠類特征肽段檢測結果

圖1 3 個物種膠原蛋白COL I型α1序列差異比對Fig. 1 Sequence alignment of collagen I α1 in 3 species

圖2 3 個物種膠原蛋白COLI型α1序列三螺旋域與非三螺旋域Fig. 2 Triple helix domain and non-triple helix domain of collagen I α1 sequence in 3 species

3 個物種膠原蛋白C O L I型α1序列差異比對見圖1。在證實的4 條特征肽中，阿膠特征肽1066GEAGPAGPAGPIGPVGAR1083、新阿膠特征肽1069GETGPAGPAGPVGPVGAR1086和黃明膠特征肽1066GETGPAGPAGPIGPVGAR1083具有很強的相似性：1）3 條肽段所在序列位置相近，前12 個氨基酸殘基位于序列中的非三螺旋結構域，其余6 個則位于最后一段三螺旋結構域的起始位置（圖2）；2）3 條肽段均由18 個氨基酸組成，氨基酸排列順序極為相似，僅有2 處氨基酸殘基存在差異；3）序列中氨基酸均未發生修飾。由于三螺旋結構是膠原蛋白的特有結構，膠原蛋白所特有的羥脯氨酸是膠原三螺旋結構形成氫鍵的必需氨基酸，由此推斷，在膠原蛋白非螺旋域附近更容易獲得未經過修飾的氨基酸序列。

由于在驢、豬、牛的I型膠原蛋白α1序列相似位置都驗證到具有物種專屬性的特征肽，因此通過考察不同動物模擬酶切后的I型膠原蛋白α1序列，發現很多動物在此相似序列位置均可找到符合上述規律且適合三重四極桿串聯質譜測定的差異肽段。這一發現得到相關文獻印證，驢、馬同屬馬科，親緣性強，GEAGPAGPAGPIGPVGAR[28]為驢和馬共有特征肽；GETGPAGPAGPIGPVGAR[28]為牛（哺乳綱，偶蹄目，牛科，牛屬）的特征肽段，GETGPAGPAGPVGPVGAR[28]為豬（哺乳綱，偶蹄目，豬科，豬屬）的特征肽段，GETGPAGPAGPPGPAGAR[29]為雞（哺乳綱，雞形目，雉科，原雞屬）特征肽段，GESGPAGPAGAMGPAGPR[30]為魚（軟骨魚綱、硬骨魚綱）特征肽段。因此初步推斷，分屬不同科或更高生物分類級別的動物在此序列位置容易找到差異肽段，這一點為今后探索膠原蛋白物種差異性及相關食品、藥品真偽鑒別方法的建立提供了啟發和思路。

模擬胰蛋白酶酶切3 條特征肽所在的非螺旋域序列，選取長度適合三重四級桿串聯質譜分析的肽段，利用MRM方法對酶切肽段進行驗證，結果表明有個別肽段在酶切后沒有驗證到（表3），因此推斷此區域肽鏈很可能在加工過程中就已發生斷裂。肽段①和肽段⑩在制膠后仍然能驗證到（驢、豬、牛膠原蛋白的肽段⑩位置均為各自的特征肽），這說明非酶切斷裂處雖然靠近螺旋域的兩端，但并不是發生在三螺旋域和非三螺旋結構交界處，而是位于交界處向非三螺旋域延伸約10～25 個氨基酸殘基處，非螺旋區域中段的肽段基本保持完整（圖3）。大部分蛋白質中脯氨酸含量極低，而膠原蛋白中含有大量脯氨酸和羥脯氨酸，這兩種氨基酸都是環狀結構，因此膠原蛋白具有微彈性和很強的拉伸強度。以上研究表明，膠原蛋白肽鏈具有一定的拉伸強度，在高溫加工過程中非螺旋域序列不會完全斷裂，大部分肽段具有較好的熱穩定性。

表3 制膠過程中非三螺旋域源肽段裂解情況Table 3 Cleavage of non-triple helix domain peptides during industrial processing of donkey-hide gelatin

圖3 制膠過程中非三螺旋域裂解位點的比較分析Fig. 3 Comparison of non-triple helix domain cleavage sites during industrial processing of donkey-hide gelatin

2.4 馬皮膠特征肽的檢測結果

由于驢和馬同為馬科（Equidae）馬屬（Equidae），膠原蛋白親緣性太強，因此馬皮膠、生馬皮的膠原蛋白的酶切溶液中可驗證到驢的特征肽GEAGPAGPAGPIGPVGAR。利用Nano-UPLC-QTOFMS鑒定結果尋找馬皮膠的特征肽，采用ProteinPilot軟件搜索Uniprot數據庫中物種蛋白序列信息，在置信度99%條件下，獲得了2 條來自馬源特征肽，其中一條LSVEADIN*GLR（*表示脫酰胺修飾）來源于馬源角蛋白。角蛋白是構成表皮、毛皮及毛囊的主要蛋白質，由此可以分析得知這條肽段是由于皮類原料中殘留的毛發或毛囊所帶入的。但由于這條肽段豐度不高，在實際應用中需要對樣品進行一定程度的濃縮處理。毛發和毛囊在生皮原料中很難完全去除，因此，從角蛋白角度尋找不同物種間的差異肽段實現溯源具備理論可行性。另一條馬的專屬特征肽ISGEWYSIFLASDVK，數據庫信息尚不完全，目前肽段所屬蛋白和源基因都未經命名，有待進一步研究。2 條肽段經過深加工過程仍能檢測到，說明特征肽段穩定性良好，適合作為馬皮特征肽。

表4 馬皮膠特征肽段的MRM參數Table 4 MRM parameters for speci fi c peptides from horse-hide gelatin

利用Skyline軟件構建馬皮特征肽MRM方法離子對，通過高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，在生馬皮酶解溶液、馬皮膠酶解溶液中均檢測到馬皮特征肽離子，進一步證實了馬皮特征肽的存在，且這2 條特征肽在阿膠、新阿膠、黃明膠樣品中均未發現，即證明此2 條肽段為馬皮膠的專屬特征肽段。馬皮膠特征肽二級質譜圖見圖4，驢、馬、牛、豬皮源特征肽段XIC圖見圖5。

圖4 Nano-HPLC-QTOF-MS對馬皮膠特征肽的鑒定結果Fig. 4 Identification of specific peptides from horse-hide gelatin by Nano-HPLC-QTOF-MS

圖5 高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀對特征肽的鑒定結果Fig. 5 Identification of marker peptides by tandem mass spectrometry

3 結 論

針對阿膠中摻入新阿膠（豬皮膠）、黃明膠（牛皮膠）等低價膠類藥材以及阿膠原料皮混雜馬皮的現象，本研究從肽段層面解決阿膠中異源性物種的鑒別問題。首先利用鳥槍蛋白組學技術在I型膠原蛋白中分別檢測到驢、牛和豬的特征肽段共4 條，可用于鑒別阿膠中摻入的新阿膠及黃明膠。其次在馬源角蛋白和未命名蛋白中獲得了2 條馬皮特征肽段，可用于鑒別阿膠驢皮原料中混雜的馬皮。同時，制膠過程中I型膠原蛋白的裂解規律以及膠原蛋白源物種特異肽段的序列特征的發現，不僅為從事阿膠異源性物種鑒別的科研人員提供了理論參考，還可以為其他動物源性食品或藥材的物種鑒定提供理論指導和技術支持。